《Journal of Chromatography A》：Multistage Screening and Fraction-Knockout Validation of Pancreatic Lipase Inhibitors from
Ganoderma lucidum Using Counter-Current Chromatography
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•一种协同的灵芝提取物混合物被发现能有效抑制脂肪酶。•基于HSCCC的敲除策略验证了脂肪酶抑制成分。•通过HSCCC从灵芝中制备性分离出灵芝醇A。•首次证明灵芝醇A能有效抑制胰脂肪酶。引言灵芝作为功能性食品和药用真菌被广泛食用，尤其是在东亚国家。其主要成分包括多糖、三萜类化合物、
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一种协同的灵芝提取物混合物被发现能有效抑制脂肪酶。
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基于HSCCC的敲除策略验证了脂肪酶抑制成分。
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通过HSCCC从灵芝中制备性分离出灵芝醇A。
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首次证明灵芝醇A能有效抑制胰脂肪酶。
引言
灵芝作为功能性食品和药用真菌被广泛食用，尤其是在东亚国家。其主要成分包括多糖、三萜类化合物、甾醇、蛋白质和核苷[1]。目前对其降脂成分的研究主要集中在灵芝多糖、三萜类化合物如灵芝酸A、腺苷以及孢子油中的脂溶性成分。据报道，这些成分可降低总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，并减轻肝脏脂质沉积。其潜在机制可能涉及Nrf2/Keap1、NF-κB、LXRα-ABCA1/ABCG1和PPAR信号通路，从而促进胆汁酸合成和胆固醇逆转运，并调节肠道菌群[[2], [3], [4], [5]]。尽管有这些发现，灵芝中负责胰脂肪酶抑制的成分仍未完全表征。
降脂活性可通过胰脂肪酶或HMG-CoA还原酶抑制试验、脂肪细胞或肝细胞中的脂质积累试验、高脂饮食动物的血清脂质和组织学评估，以及代谢组学谱、肠道菌群和临床脂质参数的分析来评估[[1], [2], [3],[5], [6], [7]]。胰脂肪酶抑制反映了对膳食三酰甘油水解的抑制，因此提供了一种有效的初始体外筛选方法[6]。目前对灵芝的研究主要考察了多糖、总三萜、粗提物和孢子来源的产品[1,2,8]。尽管灵芝酸A已被报道可改善高脂血症[3]，但灵芝酸甲酯已被证明能抑制米黑根毛霉脂肪酶并影响3T3-L1前脂肪细胞[7]。Hajjaj等人从灵芝中分离出四种26-氧代甾醇，并评估了它们对人肝T9A4细胞中胆固醇生物合成的影响。灵芝醇A通过干扰羊毛甾醇14α-去甲基化来抑制这些细胞中的胆固醇生物合成[9]。然而，对灵芝中单个化合物针对胰脂肪酶的系统筛选及相应的机制研究仍然有限。因此，本研究旨在建立一种生物活性引导的分离和多层次验证方法，以从灵芝中鉴定降脂化合物并阐明其潜在机制。
来自天然产物的胰脂肪酶抑制成分可通过亲和超滤-质谱、柱前配体捕获、柱上固定化酶筛选、柱后在线生物活性检测以及色谱指纹-生物活性关系分析来发现[[10], [11], [12]]。在这些方法中，生物活性引导的分馏仍是一种广泛应用的方法[13]。传统的固相柱色谱可能导致不可逆吸附，从而降低样品回收率。相比之下，由于高速逆流色谱（HSCCC）的分离由液-液分配控制，可以消除与固体固定相吸附相关的损失，并获得100%的回收率。这使得HSCCC成为一种有用的色谱技术，可用于使用分级敲除策略从复杂天然产物中分离、筛选和验证生物活性成分[14,15]。在分级敲除分析中，通过比较分离级分的活性与相应分级敲除样品的活性来评估所选色谱区域的贡献，并以母体提取物作为额外参考[16]。这种比较将去除级分中集中的活性与其余成分中保留的活性区分开来。因此，将胰脂肪酶抑制引导的筛选与HSCCC结合，可能有助于从灵芝中高效定位和制备性分离活性化合物。
在本研究中，采用涉及四个连续溶剂萃取层的重组策略，基于胰脂肪酶抑制活性确定提取层的最佳组合。随后，建立了一种HSCCC方法用于制备性分离和纯化一种羊毛甾烷型三萜。该工作流程还使得能够对活性级分进行LC-QTOF-MS/MS分析，以初步注释其成分，并为后续结构和功能验证确定候选化合物。
章节片段
仪器设备
分析型HPLC使用岛津LC-20AT系统（岛津，京都，日本）进行，该系统配备LC-20AT二元高压混合泵、SPD-20A UV-Vis检测器、带20 μL进样环的SIL-20A自动进样器、CTO-20AC柱温箱和CBM-20A通信总线模块。使用RE-2000旋转蒸发仪进行溶剂去除。胰脂肪酶抑制活性使用Tecan Spark多功能酶标仪测定。
制备分离通过以下设备进行
最佳协同提取物组合的选择
按溶剂极性递增顺序进行连续提取，得到石油醚提取物（P）、乙酸乙酯提取物（E）、正丁醇提取物（B）和水提取物（W），质量得率分别为1.52%、11.55%、10.30%和76.45%。总质量回收率为99.82%。随后进行胰脂肪酶抑制引导的筛选，以确定最活跃的提取物组合及其最佳比例。在1:1比例测试的六种二元组合中，E/P（1:1）表现出
结论
本研究建立了一种活性引导的方法，将提取层重组与两步HSCCC相结合，用于从灵芝中分离胰脂肪酶抑制成分。该方法确定了协同的E/P组合，并首次通过HSCCC从灵芝中分离出灵芝醇A。LC-QTOF-MS/MS分析进一步扩展了灵芝活性级分的化学谱，提供了11个需要结构验证的初步注释
CRediT作者贡献声明
Jiayu Bai：写作-原稿，调查，正式分析，数据管理，概念化。Xueqin Zhu：正式分析，数据管理。Jialong Wang：方法学，调查。Yunzhen Kong：写作-审阅与编辑。Ye Du：概念化，调查。Weiming Liu：写作-审阅与编辑，资源。Shengqiang Tong：写作-审阅与编辑，资源，项目管理，资金获取。
利益冲突声明
作者声明，他们没有已知的可能影响本文报告工作的竞争性经济利益或个人关系。
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利益冲突声明
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致谢
本工作得到了国家自然科学基金（资助号：22478347和21978266）和浙江省“尖兵”和“领雁”研发计划（资助号：2025C04034）的资助。
Jiayu Bai|Xueqin Zhu|Jialong Wang|Yunzhen Kong|Ye Du|Weiming Liu|Shengqiang Tong
