《Journal of Chromatography A》：Chemical characterization of the non-volatile fraction and migration assessment of a polyhydroxyalkanoate-based food contact material using LC-HRMS analysis
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随着循环经济理念的推进和环保关注度的日益提升，生物基可降解食品接触材料（food contact materials）如聚乳酸（PLA）和聚羟基脂肪酸酯（PHA）因其天然可分解的特性，作为传统石油基聚合物的可持续替代方案而日益受到重视。PHA家族由多种微生物在
随着循环经济理念的推进和环保关注度的日益提升，生物基可降解食品接触材料（food contact materials）如聚乳酸（PLA）和聚羟基脂肪酸酯（PHA）因其天然可分解的特性，作为传统石油基聚合物的可持续替代方案而日益受到重视。PHA家族由多种微生物在特定条件下产生，以羟基烷酸为单体，凭借良好的热力学特性、抗紫外性能和高生物降解性，被认为是包装领域极具前景的材料。然而，为匹配或改善传统塑料的性能，这类新材料往往需要添加多种助剂（增塑剂、抗氧剂、紫外吸收剂、交联剂、脱模剂、爽滑剂等），从而形成包含有意添加物（IAS）和非有意添加物（NIAS）的复杂化学基质。食品接触材料安全性的核心关切之一是迁移现象，即包装材料中的化学物质（包括单体残留、添加剂、降解产物、杂质等）向食品或饮料转移的过程。目前，针对PHA基食品包装材料中物质迁移的研究十分有限，且多集中于总迁移量和选定化合物的靶向测定，对迁移物质特别是NIAS的全面表征仍属空白。本研究的主要目标是对PHA包装材料的非挥发性组分进行广泛的化学表征，分别对颗粒形态（代表原料）和薄膜形态（代表挤出加工后的最终产品）进行评估。研究人员采用极性有机溶剂提取样品，并运用非靶向LC-HRMS方法进行分析。此外，还使用多种食品模拟物和真实食品样品（包括酒精饮料和苹果汁）对PHA薄膜进行了迁移实验。通过内部数据库和已发表的科学文献对PHA低聚物及其他NIAS进行鉴定和结构解析，并利用Cramer规则等计算机预测模型评估所检出化合物的毒性。据研究人员所知，这是首次对PHA材料组分向真实食品中的非靶向迁移进行分析的研究。
论文解读文章
一、研究背景与意义
随着全球对循环经济和环境保护的关注日益加深，生物基可降解食品接触材料作为传统石油基塑料的可持续替代方案受到广泛关注。聚羟基脂肪酸酯（PHA）是由多种微生物在特定条件下产生的一类生物聚酯，以羟基烷酸为单体，具有优良的热力学性能、抗紫外性能和高生物降解性。然而，PHA材料在商业化应用中仍面临诸多挑战，包括生产成本高、原料种植的环境影响、以及力学性能和阻隔性能方面的局限性（如热稳定性差、剪切黏度低和熔体弹性强度不足），这些问题制约了其加工性能及对传统塑料的完全替代。
为匹配或改善传统塑料的性能，PHA材料通常需要添加多种助剂（如增塑剂、抗氧剂、紫外吸收剂、交联剂等），从而形成包含有意添加物（IAS）和非有意添加物（NIAS）的复杂化学基质。NIAS包括杂质、反应产物和降解产物等，其中低聚物是聚合过程中不可避免形成的副产物或使用过程中产生的降解产物，是NIAS的特殊类别。食品接触材料安全性评估的核心关切是迁移现象——包装材料中的化学物质向食品或饮料转移的过程。迁移化合物可能影响食品的感官品质，甚至对消费者健康构成风险。然而，目前针对PHA基食品包装材料中物质迁移的研究十分有限，已有研究主要集中于总迁移量和选定化合物的靶向测定，对迁移物质特别是NIAS的全面表征仍属空白。因此，建立PHA材料的化学物质提取和迁移评估方案，作为风险评估的第一步，具有重要的科学意义和实际应用价值。
二、研究内容概述
本研究旨在对PHA包装材料的非挥发性组分进行广泛的化学表征，评估对象包括颗粒形态（代表原材料）和薄膜形态（代表挤出加工后的最终食品接触产品）。研究人员采用乙腈（ACN）作为提取溶剂，在70°C下浸泡24小时进行提取，以代表最严苛的提取场景。同时，依据欧盟委员会法规（EU）10/2011的指导原则，使用10%和95%乙醇水溶液作为食品模拟物，以及伏特加（37.5%酒精体积分数）和苹果汁作为真实食品样品，开展迁移实验。所有提取液和迁移溶液均采用液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）联用技术进行分析，使用Orbitrap Q Exactive质谱仪配备加热电喷雾电离源（HESI），在正负两种电离模式下进行数据采集。化合物鉴定采用内部数据库检索、数据库比对、MS/MS碎片解析和计算机预测模型等多种策略相结合的方法。
三、关键技术方法
本研究采用的核心技术方法包括：一是非靶向LC-HRMS分析方法，使用Hypersil Gold C18色谱柱进行分离，在m/z 100-1064范围内以140,000 FWHM分辨率进行全扫描采集；二是内部数据库构建与匹配策略，研究人员建立了包含不同端基（乙基端基、甲基端基、巴豆酸酯端基等）和环状结构的PHA低聚物理论数据库，涵盖单电荷和双电荷离子及多种加合物（H?、NH??、Na?、K?等）；三是靶向MS2实验，在10%、30%和50%的阶梯归一化碰撞能量下获取碎片谱图；四是结合ChemCalc?、ChemSpider?、SciFinder?、PubChem?和MetFrag?等工具进行未知化合物的结构解析；五是采用Cramer决策树和Toxtree软件进行毒性危害的计算机预测评估。样本来源为一家保密供应商提供的面向欧盟市场的PHA颗粒材料，薄膜由颗粒经单螺杆挤出机制备。
四、研究结果
4.1 PHA低聚物的初步鉴定
通过内部数据库比对和MS/MS碎片解析，研究人员在颗粒和薄膜提取物中初步鉴定出37种PHA低聚物，分为两组：第一组包含19种线性PHA低聚物（从三聚体n=3到十二聚体n=12，以及从十六聚体n=16到二十四聚体n=24）；第二组包含18种具有巴豆酸酯端基或环状结构的PHA低聚物（从三聚体n=3到十二聚体n=12，以及从十七聚体n=17到二十四聚体n=24）。根据Schymanski分级体系，大多数鉴定结果达到2b级置信水平。研究发现，相邻峰组间最强离子的m/z差值均为86.0368 Da，与羟基丁酸酯（HB，C?H?O?）重复单元的单同位素质量一致。基于链长，PHA低聚物分为两个簇：簇I包含少于12个HB单体的低分子量低聚物（20种化合物），主要以单电荷离子加合物形式检出；簇II包含超过16个HB单体的高分子量低聚物（18种化合物），以双电荷离子形式检出。MS/MS碎片分析显示，最常见的碎片离子包括m/z 69.0342、87.0445和105.0549（对应质子化单体连续丢失两分子水、一分子水和不失水），以及m/z 155.0701、173.0807和191.0913（对应质子化二聚体的相应中性丢失），与已有文献报道的PHA碎片化模式一致。Cramer分类评估显示，从六聚体开始的化合物被归类为Cramer III类，提示存在潜在较高毒理学关注的结构警示。
4.2 非挥发性未知化合物的非靶向筛查
除PHA低聚物外，研究人员还鉴定出一系列化合物，主要为抗氧剂Irganox 1010（季戊四醇四[3-(3,5-二叔丁基-4-羟苯基)丙酸酯]）的降解产物。由于Irganox 1010的m/z超出采集范围（>1064）而无法直接检测，但其存在可通过降解产物推断。鉴定出的降解产物包括：三酯水解产物季戊四醇三(3,5-二叔丁基-4-羟基氢化肉桂酸酯)、二酯水解产物、单酯水解产物，以及3,5-二叔丁基-4-羟基氢化肉桂酸。此外还发现多种氧化产物和水解-氧化复合产物，其中四种Irganox 1010衍生物为首次报道。两种Irganox 1010杂质（3-[3,5-二叔丁基-1-羟基-4-氧代环己-2,5-二烯基]丙酸和7,9-二叔丁基-1-氧杂螺[4.5]癸-6,9-二烯-2,8-二酮）也被检出，均归为Cramer III类。其他鉴定出的化合物包括十二烷基硫酸氢酯（表面活性剂）、羟基十四烷酸（PHA降解菌株的主要细胞脂肪酸）以及壬二酰胺衍生物（生物基聚酰胺的单体组分）。另有若干化合物因质谱数据与文献不匹配而归类为未知化合物。
4.3 迁移实验
在10%乙醇模拟物中，检出10种化合物，包括线性PHA三聚体至五聚体、巴豆酸酯端基/环状结构的三聚体和四聚体，以及部分添加剂和未知化合物。在95%乙醇模拟物中，检出所有第一簇线性低聚物（n=3至n=12）及第二簇的十九聚体和二十聚体，所有在ACN提取物中鉴定的巴豆酸酯端基/环状结构低聚物（除十七聚体外）也被检出。值得注意的是，两种食品模拟物中均检出一种在ACN提取物中未出现的化合物——十二烷基3,4,5-三羟基苯甲酸酯（C??H??O?），其碎片模式与ACN提取物中两个未知化合物的碎片一致，提示该化合物可能以低于ACN筛查检测限的浓度存在于薄膜中。低分子量低聚物主要出现在10%乙醇模拟物中，而高分子量低聚物仅在95%乙醇模拟物中检出，与EFSA此前的安全性评估结果一致。在伏特加样品中，检出巴豆酸酯端基/环状结构的三聚体至九聚体PHA低聚物、多种Irganox 1010降解产物以及十二烷基3,4,5-三羟基苯甲酸酯。在苹果汁样品中，在所用分析条件下未检出任何PHA相关化合物或添加剂，但研究人员指出，为防微生物变质而添加的叠氮化钠可能影响电离效率和基质效应，且该实验采用了不同的温度、接触时间和更小的进样体积，因此该结果不应被解释为不存在迁移的证据。
五、讨论与结论
本研究通过非靶向LC-HRMS方法对PHA包装材料的非挥发性化学组分进行了全面表征，揭示了包含多种PHA低聚物、Irganox 1010降解产物及杂质等在内的化学多样性特征。颗粒和薄膜形态表现出总体相似的定性化学轮廓，但个别化合物的检出存在差异。迁移实验证明了多种PHA相关物质在测试条件下具有迁移潜力，但该评估的定性性质无法可靠确定迁移程度和消费者暴露水平。Cramer决策树的计算机评估将若干初步鉴定化合物的中性母体结构归为Cramer III类，表明基于其化学结构不能假定低毒性，需要进一步的毒理学评估。本研究的主要局限性在于：大多数化合物仅为初步鉴定，因缺乏合适的分析标准品而无法准确定量；许多物质的毒理学信息仍然有限。因此，未来研究应聚焦于确认相关物质的身份并量化其迁移量，同时开展适当的毒理学评估，以支持PHA基食品接触材料更全面的安全性评价。
