腰果叶肠道微生物发酵代谢物与抑郁症的关联：基于体外与计算机模拟分析的见解

《Journal of Agriculture and Food Research》：Gut Microbial Fermentation Metabolites of Cashew Leaves Associated with Depression: Insights Through in vitro and in silico analyses

　　

红黄两色腰果叶富含酚类物质和膳食纤维，可调节肠道菌群。与重度抑郁症（MDD）相关的菌群分类单元，包括Erysipelatoclostridiaceae和Erysipelotrichae，在粪便发酵后减少。有益细菌，尤其是Roseburia和Phascolarctobacterium，在粪便发酵过程中得到富集。丁酸盐产量及预测的神经递质前体生物合成途径被上调/增强。相较于抑郁受试者，健康受试者的肠道菌群能将酚类化合物更高效地分解为酚酸。

研究背景与目的

抑郁症，临床称为重度抑郁症（major depressive disorder, MDD），是一种常见且令人衰弱的精神健康障碍，全球终生患病率为15%-20%，女性发病率约为男性的两倍。其病因涉及遗传、生理、社会和心理等多重因素的复杂交互作用。尽管药物治疗和心理治疗已显示出一定效果，但生活方式的平衡，特别是均衡营养和饮食，在抑郁症治疗中扮演着至关重要的角色。多酚，尤其是类黄酮，已被多项研究证实对改善抑郁症状具有积极作用。腰果叶在南亚和东南亚国家是一种独特且被广泛食用的叶片，富含多酚。然而，摄入的多酚仅有5%-10%被人体直接消化利用，其余90%-95%会进入肠道与肠道菌群相互作用，被分解为高生物活性的低分子量酚类代谢物，同时反过来影响肠道菌群组成。已有研究表明肠道菌群稳态可通过适当的底物喂养进行调节，并在影响宿主情绪和心理方面发挥重要作用。尽管已有研究发现了腰果叶对Wistar大鼠脑功能的直接影响，但目前尚无文献交叉比较肠道菌群对腰果叶消费的影响、肠道微生物代谢物及其与抑郁症相关细胞级联反应的关联。因此，本研究旨在表征两种腰果叶品种的酚类组成，并使用体外粪便批次发酵模型，比较其对健康个体和重度抑郁症患者肠道菌群的影响，同时评估微生物代谢物和预测功能通路，以阐明腰果叶多酚潜在的益生元和抗抑郁相关机制。

研究概述与结论

研究人员对红色腰果叶（red cashew leaves, RCL）和黄色腰果叶（yellow cashew leaves, YCL）进行了基本营养成分分析、酚类和黄酮类含量测定、模拟上消化道消化实验，并利用来自10名健康志愿者和10名经严格心理筛查确诊的重度抑郁症志愿者的粪便样本，建立了体外粪便批次发酵模型。通过16S rRNA基因扩增子测序分析了肠道菌群的组成变化，利用液相色谱-四极杆飞行时间质谱（LC-QTOF-MS）鉴定了酚类代谢物谱，并通过气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）定量了短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）和支链脂肪酸（branched-chain fatty acids, BCFAs）的产生。研究得出结论：腰果叶，特别是YCL，能够显著调节肠道菌群，抑制与MDD相关的有害菌（如Erysipelatoclostridiaceae和Erysipelotrichae），促进有益菌（如产丁酸的Roseburia和与情绪调节相关的Phascolarctobacterium）的生长，并显著提升丁酸盐产量。此外，健康个体的肠道菌群比抑郁个体更能有效地将腰果叶中的酚类化合物分解为小分子酚酸，并产生了可能具有抗抑郁作用的苯基-γ-氨基丁酸（phenyl-GABA）。这些发现揭示了腰果叶作为一种潜在的功能性食品，通过调节肠道菌群及其代谢产物来缓解抑郁症的可能性。

主要关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：1）基本营养成分分析，用于测定腰果叶的水分、脂肪、纤维、蛋白质和灰分含量；2）总酚和总黄酮含量测定，分别使用福林酚法和氯化铝法；3）高效液相色谱法（HPLC）定量特定化合物金丝桃苷；4）模拟上消化道消化，包括口腔、胃和肠相，并使用1 kDa透析膜模拟吸收；5）体外粪便批次发酵模型，使用来自泰国宋卡王子大学伦理委员会批准的10名健康志愿者和10名抑郁症志愿者的粪便样本制备接种物；6）16S rRNA基因（V3-V4高变区）扩增子测序，在QIIME 2平台处理数据，使用DADA2去噪获得扩增子序列变异体（amplicon sequence variants, ASVs），并结合SILVA 138.2数据库进行物种注释；7）液相色谱-四极杆飞行时间质谱（LC-QTOF-MS）用于鉴定消化前后及发酵后的酚类化合物和代谢物；8）气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）用于定量短链脂肪酸（SCFAs）和支链脂肪酸（BCFAs）。

研究结果

3.1 基本营养成分组成

两种腰果叶的基本成分分析显示，不溶性膳食纤维是主要成分，在YCL中高达62%，在RCL中占60%。其次是蛋白质，YCL中最高达23.2%。脂肪含量最低（1.4%-1.6%）。RCL和YCL在蛋白质和膳食纤维含量上存在显著差异。

3.2 酚类和黄酮类含量

RCL的自由态酚类含量显著高于YCL，而结合态酚类含量两者无显著差异。相反，YCL在自由态和结合态的黄酮类含量上均显著高于RCL。LC-QTOF-MS分析确认了腰果叶含有丰富的酚酸、黄烷醇、黄酮醇和黄酮，其中槲皮素和山奈酚衍生物是最主要的黄酮醇亚类。RCL中特有花青素，如飞燕草素和芍药素-3-半乳糖苷，这与其红色外观相符。HPLC定量结果显示，YCL中的金丝桃苷浓度（1.46 mg/g）略高于RCL（1.31 mg/g）。

3.3 上消化道消化特性

模拟消化实验表明，胃相是释放酚类和黄酮类化合物的主要阶段。YCL在口腔相释放的酚类和黄酮类显著多于RCL。消化过程改变了酚类谱，许多糖苷转化为苷元，并出现了消化前未检测到的化合物，如木犀草素等。

3.4 肠道菌群描述

3.4.1 β多样性

主坐标分析（PCoA）显示，发酵是驱动菌群结构变化的更强因素，而非疾病状态本身。发酵使所有样品沿主轴发生一致迁移，表明其重塑了主要微生物谱系的丰度平衡。

3.4.2 α多样性

Chao1指数分析表明，纯化合物槲皮素表现出抗菌活性，降低了菌群丰度。腰果叶发酵对健康组菌群丰富度影响不显著，但在抑郁组中增加了微生物丰富度的变异性。总体而言，抑郁组的菌群在发酵后显示出更高的估计物种丰富度。

3.4.3 肠道菌群组成

在科水平上，研究发现与MDD相关的Erysipelatoclostridiaceae、Erysipelotrichae和Christensenellaceae在抑郁受试者中存在，发酵后其丰度下降。促炎性的瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）和与慢肠道转运相关的古菌Methanobrevibacter在发酵后也减少。毛螺菌科（Lachnospiraceae）在发酵后增加。在属水平上，产丁酸的罗斯氏菌属（Roseburia）和与情绪调节相关的考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）在发酵后显著富集，尤其在抑郁组中。拟杆菌属（Bacteroides）在发酵后增加。双歧杆菌属（Bifidobacterium）在发酵后丰度下降但未消失。槲皮素则促进了克雷伯菌属（Klebsiella）的生长。

3.5 代谢组学分析

槲皮素发酵产生了一系列代谢物，包括异鼠李素、山奈酚、8-羟基槲皮万寿菊素、桑色素和紫杉叶素。紫杉叶素仅在抑郁组中检测到，表明健康组的菌群能更彻底地将其分解为下游酚酸。健康组共鉴定出29种酚酸及其缀合物，多于抑郁组的25种。值得注意的是，可能具有抗抑郁作用的苯基-GABA仅在健康组中产生。腰果叶发酵产生的酚类代谢物种类更多，健康组鉴定出49种，抑郁组41种。没食子酸是抑郁组中最主要的代谢物，而苯乳酸是健康组中最主要的。水解单宁被转化为鞣花酸和尿石素B。黄烷-3-醇最终被生物转化为表儿茶素、戊酸衍生物和低分子量酚酸。

3.6 短链脂肪酸和支链脂肪酸的产生

SCFA和BCFA的分析结果显示，YCL在健康组中诱导了最显著的丁酸增加（从基线增加10.63 mM，终浓度达15.53 mM），而RCL在抑郁组中也导致了较高的丁酸增加（增加6.06 mM）。乙酸在RCL的健康组发酵中大幅增加，而在YCL中因基线值较高，净增量较小。丙酸和戊酸的增长相对温和。对于BCFA，异丁酸在抑郁组发酵中从零开始显著增加，而异戊酸在所有发酵中均有增加。槲皮素发酵中未检测到异丁酸。

总结与讨论

本研究的结论部分指出，腰果叶富含多酚和膳食纤维，其发酵代谢物与抑郁症密切相关。研究发现，腰果叶发酵能够减少与抑郁症相关的菌群，如Erysipelatoclostridiaceae和Erysipelotrichae，同时富集有益菌，如产丁酸的Roseburia和与情绪调节相关的Phascolarctobacterium。这一菌群结构的积极调整伴随着丁酸产量的显著提升以及预测的神经递质前体生物合成途径的上调。更重要的是，研究揭示了健康个体与抑郁个体肠道菌群在代谢腰果叶酚类物质方面的差异：健康菌群展现出更强的酚类化合物分解能力，并能产生更多样化的酚酸，甚至包括可能穿越血脑屏障的苯基-GABA。这些发现综合表明，腰果叶，特别是黄色腰果叶，作为一种潜在的益生元基质，通过调节“肠-脑轴”，即重塑肠道菌群组成并促进有益代谢物的产生，可能为抑郁症的膳食干预提供一种新的策略。