《Journal of Agriculture and Food Research》：Bioactivity-Based Molecular Networking Reveals Betaine Lipids as Potential Antimicrobials in Macroalgae
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基于活性的分子网络（Bioactivity-Based Molecular Networking，BBMN）揭示大型海藻（macroalgae）中甜菜碱脂质（betaine lipids）为潜在抗菌化合物。研究人员对源自14种大型海藻物种的51种粗提物进行了非
基于活性的分子网络（Bioactivity-Based Molecular Networking，BBMN）揭示大型海藻（macroalgae）中甜菜碱脂质（betaine lipids）为潜在抗菌化合物。研究人员对源自14种大型海藻物种的51种粗提物进行了非靶向（untargeted）分析，并采用基于活性的分子网络来探究大型复杂海藻数据集。研究鉴定出多种多样的抗菌化合物家族，其中极性甘油酯（polar glycerolipids）和间苯三酚单宁（phlorotannins，多酚类化合物）为具有前景的化合物家族。甜菜碱脂质（单甘油三甲基高丝氨酸/丙氨酸，MGTSA；双甘油三甲基高丝氨酸/丙氨酸，DGTSA）被鉴定为主要生物活性脂质。
一、研究背景与科学问题
抗菌素耐药性（antimicrobial resistance）已成为日益严峻的全球公共卫生挑战，因此新型抗菌化合物的发现与开发具有至关重要的意义。海洋生物，尤其是大型海藻（macroalgae，即海藻），因其独特的代谢组、可观的生物量以及广泛的生态分布，被视为具有前景但相对尚未充分开发的抗菌药物资源库。
在前期研究中，研究人员曾对14种大型海藻物种进行抗菌潜力筛选，通过顺序溶剂提取法获得85种粗提物并针对多种细菌进行测试，其中墨角藻（Fucus vesiculosus）的甲醇提取物表现出最强的抗菌活性，对蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）的抑菌圈（ZOI）为7.8±0.4 mm，最低抑菌浓度（MIC）为1 mg/mL。通过传统的活性引导分离方法，间苯三酚单宁被鉴定为该物种中发挥抗菌活性的主要化合物类别，且中等聚合度（DP约20）的聚合物抗菌活性最佳。然而，已有研究表明，除间苯三酚单宁外，大型海藻中还存在其他潜在未充分探索的生物活性成分。因此，本研究旨在利用非靶向代谢组学方法——基于活性的分子网络（BBMN），重新评估源自14种褐藻、红藻和绿藻物种的大型提取物库，以发现新型抗菌化合物。
二、研究内容与主要结论
研究人员聚焦于极性提取物（乙酸乙酯、甲醇和水提取物），共51种粗极性提取物纳入本研究，原因包括：这些提取物显示出良好的抗菌活性（33%的极性提取物ZOI>1 mm）、提取产率较高（甲醇和水提取物约为干重的7%），且适用于非靶向代谢组学所需的标准化分析方法。通过BBMN分析，共检测到6760个特征，其中120个特征与抗菌活性显著相关（Bonferroni校正后p<0.05）。在负离子模式下，20个相关特征的Pearson相关系数范围为0.50至0.66；正离子模式下100个相关特征的相关系数范围为0.56至0.82。其中95个特征得以初步注释，主要归属于极性甘油酯类脂质，甜菜碱脂质（betaine lipids）成为最主要的关注类别。研究人员进一步测试了多种商业可得的纯化合物以验证BBMN结果，其中单不饱和溶血甜菜碱脂质MGTS 18:1对蜡样芽孢杆菌的MIC为64 μg/mL，溶血磷脂酰乙醇胺（LPE 18:1）的MIC为128 μg/mL，二十碳五烯酸（EPA 20:5）的MIC为32 μg/mL，而双饱和甜菜碱脂质DGTS 16:0/16:0、半乳糖脂混合物（MGDG、DGDG）及两种商业间苯三酚单宁在最高测试浓度下均无活性。
三、关键技术方法
本研究采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用（UPLC-HRMS/MS）进行非靶向代谢组学分析，数据经MZmine预处理后上传至全球天然产物社会分子网络平台（GNPS）进行基于特征的分子网络（FBMN）构建。基于活性的分子网络（BBMN）依据Nothias等人开发的生物信息学流程实施，通过计算各特征相对丰度与抗菌活性之间的Pearson相关系数并进行Bonferroni校正，将生物活性信息整合至分子网络可视化中。此外，研究人员还开发了Python脚本用于创建仅包含生物活性相关特征的精选分子网络，并利用matchms包计算改良余弦分数进行光谱比对。
四、研究结果
4.1 UPLC-HRMS/MS分析粗极性大型海藻提取物
对51种粗极性大型海藻提取物进行非靶向代谢组学研究，以色谱图展示了高度复杂的混合物。正负离子化模式以及顺序溶剂提取物之间呈现明显差异，酚类化合物在负离子模式下离子化效果更好，而（溶血）脂质在正负离子模式下均能良好离子化。
4.2 基于活性的分子网络（BBMN）
4.2.1 分子网络结果概述
MZmine预处理共检测到6760个特征，正离子模式检测到的特征数量约为负离子模式的十倍（正离子6129个，负离子631个）。约2%（120个特征）与抗菌活性显著相关。
4.2.2 负离子模式网络揭示多种极性脂质和酚类为潜在抗菌化合物
负离子模式数据集中18个初步注释的相关特征可归为5类化学类别：磷脂、半乳糖脂、硫代脂质、间苯三酚单宁和未鉴定化合物。与生物活性相关性最强的特征（r=0.66）被初步鉴定为溶血磷脂酰乙醇胺（LPE 20:4）。此外还鉴定出多种半乳糖脂类化合物，包括双半乳糖单酰基甘油（DGMG）18:3、双半乳糖二酰基甘油（DGDG）36:7和36:8，以及硫代异鼠李糖单酰基甘油（SQMG）14:0、18:1、18:3和23:3。两个间苯三酚单宁特征（聚合度DP 4和5）也显示出与活性的相关性，但相关系数最低。
4.2.3 正离子模式网络鉴定甜菜碱脂质为大型海藻中具有前景的抗菌化合物类别
正离子模式数据集中56%的节点形成一个大型网络，96%的生物活性相关节点位于其中，主要归属于甜菜碱脂质和半乳糖脂（MGDG）两类。100个与活性相关的特征中，75个被初步注释为甜菜碱脂质，包括14个MGTSA和61个DGTSA。整个研究中相关性最高的两个特征（r=0.82和0.80）分别被初步注释为DGTSA 32:3（14:0/18:3）和MGTSA 14:0。此外还鉴定出一对半乳糖脂MGDG 38:6和40:9与活性相关。
4.3 潜在活性化合物的抗菌活性验证
基于BBMN结果，研究人员测试了主要化学类别的商业类似物对蜡样芽孢杆菌的MIC。MGTS 18:1（溶血甜菜碱脂质）的MIC为64 μg/mL，LPE 18:1（溶血磷脂）的MIC为128 μg/mL，EPA 20:5（多不饱和脂肪酸）的MIC为32 μg/mL。DGTS 16:0/16:0、MGDG和DGDG混合物以及两种商业间苯三酚单宁在最高测试浓度（>512 μg/mL）下均无活性。
五、讨论与结论
讨论部分指出，甜菜碱脂质是一类主要存在于藻类中的非磷甘油酯，尽管此前无该类化合物抗菌活性的报道，本研究建立了甜菜碱脂质与大型海藻抗菌活性之间的直接相关性。值得注意的是，已有研究发现细菌表面污损程度与三种大型海藻物种中甜菜碱脂质表达水平之间存在相关性，即污损程度最低的样品具有最高的甜菜碱脂质表达量。然而，观察到的相关性并不必然意味着单个甜菜碱脂质直接负责抗菌活性，提取物中不同成分之间的协同或拮抗作用也可能有所贡献。半乳糖脂类化合物与抗菌活性的相关性与此前对墨角藻的BBMN研究一致，脂肪酸不饱和度、位置排列和链长均可能影响抗菌活性。间苯三酚单宁在负离子网络中被确认与极性提取物的抗菌特性相关，但仅检测到相对较小的寡聚体（DP 4和5），更大聚合度的活性间苯三酚单宁可能因丰度低于检测阈值而未被识别。
研究结论指出，本研究对源自14种大型海藻物种的51种粗极性提取物进行了非靶向UPLC-HRMS/MS分析并结合BBMN，共120个特征与对蜡样芽孢杆菌的抗菌活性显著相关，优先确定了包括溶血磷脂、半乳糖脂和甜菜碱脂质在内的多个潜在生物活性化学类别。其中，负离子分子网络中的首要候选化合物为溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）20:4，商业可得的结构相关标准品LPE 18:1和游离脂肪酸EPA（20:5）的抗菌活性也经实验验证。甜菜碱脂质（包括MGTSA和DGTSA）在特征数量和相关性强度方面均构成最突出的生物活性相关特征组。重要的是，商业可得的甜菜碱脂质标准品MGTS 18:1对蜡样芽孢杆菌ATCC 10987表现出抗菌活性，MIC为64 μg/mL，为这一相对研究不足的非磷极性甘油酯类别中至少一个成员的抗菌潜力提供了实验支持。然而，BBMN确定的代谢物-活性相关性并不能确立单个代谢物直接负责粗提物的抗菌活性，未来研究应聚焦于优先化合物的分离与结构解析，随后进行靶向抗菌测试以确定其个体活性和构效关系，并评估提取物成分间潜在的协同或拮抗作用，以及针对更广泛的临床相关革兰氏阳性和阴性细菌进行评价。总体而言，本研究为大型海藻代谢物的靶向研究提供了基础，并突出甜菜碱脂质作为进一步抗菌研究的有前景候选化合物。
