米曲霉（Aspergillus oryzae）固态发酵（SSF）与复合酶水解对三种未充分利用安哥拉植物酚类、挥发性谱及生物活性的差异化影响

《Journal of Agriculture and Food Research》：Comparative effects of Aspergillus oryzae solid-state fermentation and enzymatic hydrolysis on phenolic and volatile profiles and bioactivities of three underutilized Angolan plants

　　

本研究比较了米曲霉（Aspergillus oryzae）固态发酵（solid-state fermentation, SSF）与酶水解对三种未充分利用安哥拉植物的酚类与挥发性谱及生物活性的影响。发酵和酶处理均促进植物酚类化合物的提取。A. oryzae SSF释放植物化学物并提高其生物活性。发酵改变酚类并富集植物的多甲基化黄酮（polymethylated flavonoids）。与酶处理相比，发酵植物提取物具有更高的抗氧化活性。发酵植物提取物具有增强的α-淀粉酶（α-amylase）和血管紧张素转换酶（angiotensin-converting enzyme, ACE）抑制活性。

Pengren Zou等围绕三种未充分利用的安哥拉食用植物——H. crinita根、P. guineense种子和X. aethiopica荚果，比较了米曲霉（Aspergillus oryzae）固态发酵（solid-state fermentation, SSF）与确定复合酶水解对可提取酚类、挥发性有机化合物（volatile organic compounds, VOCs）及生物活性的影响。研究背景在于，植物酚类既以易提取形式存在，也以与多糖、蛋白等结构组分结合的形式存在；破坏植物基质或水解糖苷键、酯键的加工策略可改变可提取酚类的数量与组成。总酚或总黄酮含量升高并不必然代表原料中该类化合物绝对量提高，也可能反映提取性增强、共轭形式转化、单体成分降解或这些过程共同作用。因此，在开发未充分利用植物资源的功能潜力时，需要评价加工导致的可提取植物化学物变化。A. oryzae SSF可产生多种胞外水解酶，改变基质可及性和植物化学成分；既有研究报道其可改变大豆、谷物、药用植物等底物的酚谱、VOCs和生物活性，且作者近期研究发现不同微生物对Dorstenia convexa根和Monodora myristica种子产生不同植物化学响应，A. oryzae具有增加黄酮苷元的潜力。关键问题是，A. oryzae SSF与确定水解处理在化学组成不同的植物基质中会产生何种相似或不同效应。酶水解较可控，而SSF为动态、原位产生广谱胞外酶的过程，可协同作用于植物细胞壁和多酚结合物；研究以木聚糖酶、α-淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶组成的复合酶作为广谱水解比较物。三种植物基质差异明显：H. crinita和P. guineense碳水化合物与蛋白相对较高，X. aethiopica脂质较高。研究比较提取率、可提取酚类与黄酮、靶向酚组成、VOCs、抗氧化能力、消化酶和血管紧张素转换酶（angiotensin-converting enzyme, ACE）抑制及抗菌活性，旨在判断两种加工策略对不同植物基质的适用性，并区分SSF效应中可由直接酶解复制的部分与更广泛发酵相关反应，为从未充分利用植物资源获取可提取植物化学物和靶向功能性质提供依据。

关键技术方法（≤250字）：样本为安哥拉北部Uíge市来源的H. crinita根、P. guineense种子和X. aethiopica荚果，干燥粉碎后分别进行A. oryzae固态发酵（比较点分别为4、4、7 d）与复合酶水解（木聚糖酶、α-淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶，各25 U/g底物，30 ℃、6 h、130 rpm），灭菌未处理样为对照。甲醇/丙酮提取后测定提取率、总酚/总黄酮、靶向酚类（高效液相色谱-串联质谱）、挥发/半挥发性成分（气相色谱-质谱）、自由基清除和铁还原抗氧化能力、α-淀粉酶/胰脂肪酶/ACE抑制及纸片扩散法抗菌（含最低抑菌浓度和最低杀菌浓度）；ANOVA+Tukey检验，p＜0.05。

3.1 Changes in extractable phenolic and flavonoid contents（可提取酚类和黄酮含量变化）：通过提取率、总酚含量（total phenolic content, TPC）和总黄酮含量（total flavonoid content, TFC）及时间进程比较发现，SSF和酶解均提高三种植物提取率、TPC和TFC；H. crinita根和P. guineense种子在SSF最佳时间增幅高于酶解，X. aethiopica荚果则酶解更有效。SSF并非持续增加可提取酚类和黄酮，H. crinita和P. guineense主要在发酵早期升高，延长发酵后下降；X. aethiopica响应延迟，第7天最高。结果表明可提取物净积累是基质可及性提高与后续转化或损失之间的动态平衡，且SSF优势具底物依赖性。

3.2 Changes in targeted phenolic composition（靶向酚类组成变化）：通过高效液相色谱-串联质谱（high-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry, HPLC-MS/MS）定量发现，两种处理均改变靶向酚谱，但变化幅度和方向随底物和化合物而异。SSF使H. crinita和P. guineense定量酚总量增幅更大，X. aethiopica以酶解更有效。SSF总体增加多种黄酮苷元及4′,5,7-trimethoxyflavone、3-hydroxy-3′,4′,5′-trimethoxyflavone和tricin等多甲基化黄酮，同时降低槲皮苷、芦丁等部分糖苷及部分酚酸。该结果为终点浓度变化，不能证明A. oryzae去新甲基化或具体代谢途径。

3.3 Changes in volatile and semi-volatile profiles（挥发性和半挥发性谱变化）：通过气相色谱-质谱（gas chromatography–mass spectrometry, GC-MS）、Venn图和层次聚类发现，两种处理改变VOCs数量和相对分布。三底物未处理样均以萜类为主；SSF使H. crinita萜类相对贡献升高，使X. aethiopica醇类等相对升高，P. guineense中两种处理差异相对较小。SSF还产生部分处理特有化合物。由于结果为相对峰面积，其反映检测到的VOCs组分组成变化，不能证明绝对浓度增加或新生物合成。

3.4 Improvement on antioxidant activities（抗氧化活性改善）：通过DPPH（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）、ABTS⁺（2,2′-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)）和铁还原抗氧化能力（ferric reducing antioxidant power, FRAP）测定发现，两种处理总体降低IC₅₀并提高Trolox当量抗氧化能力（Trolox equivalent antioxidant capacity, TEAC）。在最佳发酵时间，H. crinita和P. guineense的SSF抗氧化优于酶解，X. aethiopica则酶解略高；发酵过久可降低活性。TPC/TFC与抗氧化指标总体呈正相关，但相关性不证明因果关系。

3.5 Inhibitory potential on digestive enzyme activities（消化酶抑制潜力）：α-淀粉酶抑制在4 mg/mL提取物浓度下测定，SSF较未处理对照和酶解显著提高三底物抑制率；胰脂肪酶抑制在10 mg/mL下测定，酶解提高抑制率，而SSF未提高或略低于未处理样。结果表明发酵提高可提取酚类并不必然增强所有消化酶抑制活性。

3.6 Improvement on ACE inhibitory activity（ACE抑制活性改善）：通过ACE荧光法发现，两种处理均降低IC₅₀；SSF对H. crinita和P. guineense的改善显著大于酶解，X. aethiopica两处理差异不显著。提取物为粗提物，有效浓度多在mg/mL范围，不能将ACE抑制改善归因于单一酚类或肽类。

3.7 Modification on antimicrobial activities（抗菌活性改变）：通过纸片扩散法测定抑菌圈直径（diameter of inhibition zone, DIZ）及最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）/最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration, MBC）发现，三种提取物对Escherichia coli、Pseudomonas aeruginosa 14和Bacillus cereus具有可测抗菌活性。两种处理对DIZ总体改变有限且未显著增强抗菌活性；对P. aeruginosa 14，SSF降低三提取物DIZ，而酶解倾向增加，提示加工可能重新分布而非统一增强抗菌成分。

讨论部分强调，TPC/TFC升高应解释为可提取酚类和黄酮回收增加，而非绝对量提高或共价结合态释放的直接证据；HPLC-MS/MS和GC-MS显示处理诱导植物化学组成重塑，SSF效应具底物依赖和时间依赖，酶解表现较稳定。抗氧化与TPC/TFC相关，但不建立因果；粗提物体外抑制活性多在mg/mL范围，不能归因于单一成分；抗菌活性对加工相对不敏感。研究局限在于未测定真菌生物量、酶活、底物利用、反应中间体、基因表达或代谢通量，未确证SSF具体生化途径及结合酚释放与转化。研究结论翻译：本研究证明，A. oryzae SSF对三种安哥拉植物可提取植物化学成分和功能性质的影响强烈依赖底物类型和发酵时间，而酶处理表现稳定且一致。与确定酶水解相比，A. oryzae SSF更有效提高H. crinita根和P. guineense种子可提取酚类和黄酮含量，而X. aethiopica荚果在若干参数上对酶处理反应更有利。两种过程诱导的植物化学变化增强这三种植物基质的功能性质，但未显著改善抗菌活性。A. oryzae SSF在抗氧化能力及α-淀粉酶和ACE抑制活性方面改善更大，而酶水解更有利于胰脂肪酶抑制。总体而言，确定水解酶成功实现释放植物化学物的目标，而A. oryzae SSF对某些植物底物表现出更有前景的可持续加工策略并产生更有利结果。研究局限是未识别A. oryzae SSF或结合酚释放与转化涉及的具体生化途径；未来需结合化合物分离和结构表征与时间分辨代谢组、酶学和底物利用分析，确认这些变化的生化基础并优化靶向功能发酵条件。