《Journal of Agriculture and Food Research》：Anthophilous yeasts from northern Thailand as natural sources of ergothioneine with optimized production for food and nutraceutical applications
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消费者对具有健康益处食品的需求日益增长，推动了含有生物活性化合物的功能食品和营养保健品的开发。麦角硫因（ergothioneine，EGT）是一种天然含硫氨基酸衍生物，具有强抗氧化和自由基清除能力，因其优异的稳定性、商业潜力及适用于功能食品的特性而备受关注。微
消费者对具有健康益处食品的需求日益增长，推动了含有生物活性化合物的功能食品和营养保健品的开发。麦角硫因（ergothioneine，EGT）是一种天然含硫氨基酸衍生物，具有强抗氧化和自由基清除能力，因其优异的稳定性、商业潜力及适用于功能食品的特性而备受关注。微生物相比植物在生物活性代谢物生产方面具有生长速度快、生产周期短、可规模化培养等优势。本研究从泰国北部采集的61份花样品中分离获得305株嗜花酵母，经高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）筛选，首次发现60个物种（分属18个属）具有EGT生产能力，显著扩展了已知具备EGT生物合成能力的酵母分类学多样性。其中，Pseudozyma chiangmaiensis SDBR-CMU980菌株表现出最高的EGT产量（13.72 mg/L）。研究人员通过单因素优化策略，系统考察了初始培养基pH、接种比例、氨基酸前体（组氨酸与甲硫氨酸）比例及浓度、培养时间等培养条件，使EGT产量提升至42.16 mg/L，较优化前提高2.37倍。经部分纯化后，EGT在Ca2?离子存在下表现出优异的稳定性（保留率>95%），在pH 5–8范围内保持稳定，并耐受高压灭菌、微波处理及100°C连续加热5天等热处理条件。抗氧化活性评估显示，部分纯化EGT的DPPH、ABTS和FRAP半数抑制浓度（IC??）值与EGT标准品无显著差异。此外，部分纯化EGT可促进凝结芽孢杆菌（Heyndrickxia coagulans）和鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）两种益生菌的生长。该研究为嗜花酵母作为EGT新型微生物来源提供了证据，并展示了其在食品和营养保健领域的应用潜力。
一、研究背景与科学问题
随着全球人口老龄化加剧及消费者对健康食品需求的持续增长，具有抗氧化、抗炎及延缓衰老等功能的生物活性化合物受到广泛关注。麦角硫因（ergothioneine，EGT）是一种天然含硫氨基酸衍生物，具有强抗氧化和自由基清除能力，人体无法自身合成，需通过膳食摄入。EGT已被欧盟批准为新型食品配料，并获得美国FDA的GRAS（Generally Recognized as Safe）认证，可用于食品、饮料及化妆品等领域。全球EGT市场预计将从2024年的约5460万美元增长至2030年的3.871亿美元，年复合增长率达38.6%。目前EGT主要来源于蘑菇、放线菌及部分丝状真菌，而酵母作为EGT生产来源的研究仍较有限，已报道的产EGT酵母仅涉及少数属种，花卉生态位中的酵母资源尚未被充分开发。因此，探索新的微生物来源并优化其EGT生产能力具有重要的科学意义和应用价值。
二、研究内容与主要结论
研究人员从泰国北部61份花样品中分离获得305株嗜花酵母菌株，通过HPLC分析筛选EGT生产能力。结果显示，205株担子菌酵母具有EGT生产能力，产量范围为0.02–13.72 mg/L，而所有63株子囊菌酵母均不产EGT，这与担子菌中egt1基因的保守性及子囊菌亚门Saccharomycotina中该基因缺失的进化背景一致。其中，Pseudozyma chiangmaiensis SDBR-CMU980菌株产量最高（13.72 mg/L），被选为进一步研究对象。研究人员通过考察氨基酸前体（半胱氨酸Cys、组氨酸His、甲硫氨酸Met）及其组合对EGT产量的影响，发现His与Met联合补充效果最佳，P. chiangmaiensis SDBR-CMU980产量提升至29.19 mg/L。随后通过单因素优化实验，确定了最优培养条件：初始pH 4.0、接种比例5%（v/v）、His:Met比例0.75:0.25、氨基酸总浓度2 g/L、培养7天，最终EGT产量达42.16 mg/L，较优化前提高2.37倍。部分纯化后EGT含量从425 mg/g提升至650 mg/g干提取物，回收率约91.8%。抗氧化活性评估显示，部分纯化EGT的DPPH、ABTS和FRAP的IC??值与EGT标准品无显著差异。稳定性测试表明，EGT在Ca2?存在下保留率>95%，在pH 5–8范围内稳定，并耐受高压灭菌、微波处理及100°C连续加热5天。益生菌生长实验显示，EGT可促进凝结芽孢杆菌（Heyndrickxia coagulans）和鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）的生长。
三、主要关键技术方法
研究人员主要采用了以下关键技术方法：从泰国北部61份花样品中分离获得305株嗜花酵母菌株，基于形态学特征及大亚基rRNA基因D1/D2域和内部转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）的分子数据进行菌种鉴定；采用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）对酵母细胞内EGT进行提取、检测与定量分析；通过单因素实验系统优化培养条件；采用制备型快速色谱系统对EGT进行部分纯化；利用DPPH、ABTS和FRAP三种方法评估抗氧化活性；通过金属离子暴露、pH变化、高压灭菌、微波处理及高温孵育评估EGT稳定性；采用稀释涂布平板法测定益生菌活菌数。
四、研究结果
4.1 嗜花酵母EGT生产能力的筛选
HPLC分析确认了各嗜花酵母菌株提取物中EGT的存在，标准品保留时间为4.10 min。305株酵母分属39个属，其中担子菌门242株（12属）、子囊菌门63株（27属）。205株担子菌酵母具有EGT生产能力，产量范围为0.02–13.72 mg/L。所有63株子囊菌酵母均不产EGT。27株（15个种）为高产量菌株，11株（9个种）为极高产量菌株。P. chiangmaiensis SDBR-CMU980产量最高（13.72 mg/L），其次为Moesziomyces antarcticus SDBR-CMU634（12.73 mg/L）和Papiliotrema tectonae SDBR-CMU632（12.00 mg/L）。本研究首次报道了18个属60个种的EGT生产能力，显著扩展了已知产EGT酵母的分类多样性。
4.2 氨基酸前体对EGT产量的影响
研究人员选取17株代表性高产菌株及1株不产EGT对照菌株，考察Cys、His、Met及其组合对EGT产量的影响。结果表明，His和Met及其组合总体上促进EGT产量提升，而Cys补充效果有限甚至降低产量。P. chiangmaiensis SDBR-CMU980在His+Met条件下产量最高（29.19 mg/L），其次为P. pollinicola SDBR-CMU619（28.31 mg/L）。主成分分析（principal component analysis，PCA）结合K-means聚类将菌株分为高产、中产、低产和不产四组，His+Met、Cys+His+Met和Met是PC1的主要贡献因素，证实Met通过提供S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）作为甲基供体驱动EGT生物合成，而His提供咪唑骨架。
4.3 选定酵母菌株EGT生产的培养条件优化
P. chiangmaiensis SDBR-CMU980在YMB中24 h进入稳定期。初始pH实验中，pH 4.0获得最高生物量（122.80 mg）和EGT产量（17.74 mg/L）。接种比例实验中，5%（v/v）获得最高EGT产量（15.42 mg/L）。His:Met比例实验中，0.75:0.25获得最高EGT产量（33.17 mg/L）。氨基酸总浓度实验中，2 g/L获得最高EGT产量（41.17 mg/L）和生物量（123.50 mg）。培养时间实验中，细胞内EGT在第7天达到最高（42.16 mg/L），且EGT主要在稳定期积累；第7天后胞外EGT出现并增加，可能与细胞裂解有关。优化后EGT产量较YMB基础条件提高2.37倍。
4.4 EGT的部分纯化
经制备型色谱分离，EGT浓度从初始冻干提取物的425 mg/g提升至部分纯化组分的650 mg/g干提取物，回收率约91.8%。HPLC分析确认部分纯化组分在4.10 min处出现与EGT标准品一致的主峰。
4.5 部分纯化EGT的抗氧化活性
DPPH、ABTS和FRAP三种方法评估结果显示，部分纯化EGT的IC??值（分别为20.15、122.42和30.08 μg/mL）与EGT标准品（分别为19.07、120.01和29.80 μg/mL）无显著差异，表明其具有良好的抗氧化能力。
4.6 部分纯化EGT的稳定性
金属离子实验中，EGT在CaCl?存在下保留率>95%；CuCl?和FeCl?呈浓度依赖性降低EGT保留率，1,000 μM时分别降至58.54%和42.89%；FeSO?影响较小，1,000 μM时保留率约81.15%。pH实验中，EGT在pH 5–8范围内保持稳定（保留率>90%），在强酸（pH 2–3）和强碱（pH 9–10）条件下稳定性下降。热稳定性实验中，经3次高压灭菌循环后保留率约95%；微波处理3–10 min保留率>98%；100°C连续加热5天保留率>90%。
4.7 部分纯化EGT对益生菌生长的影响
部分纯化EGT在10–250 mg/L浓度范围内可促进凝结芽孢杆菌（Heyndrickxia coagulans）和鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）的生长，表明EGT可能通过抗氧化保护作用支持益生菌增殖。
五、讨论与结论
讨论部分指出，担子菌酵母比子囊菌酵母具有更强的EGT生产能力，这与真菌egt1基因在担子菌中的保守性及在Saccharomycotina亚门中的缺失一致。His+Met联合补充的增效作用与EGT生物合成途径中His作为咪唑骨架前体、Met通过SAM提供甲基供体的机制相符。Cys补充效果有限可能与过量Cys的毒性及硫代谢分流有关。EGT在Ca2?存在下的高稳定性及对Cu2?和Fe3?的敏感性提示，在食品配方和储存中需考虑金属离子交互作用。EGT在pH 5–8及多种热处理条件下的高稳定性支持其在食品加工中的应用潜力。研究结论表明，嗜花酵母是EGT的新型微生物来源，P. chiangmaiensis SDBR-CMU980经培养条件优化后EGT产量达42.16 mg/L（提高2.37倍），部分纯化EGT具有与标准品相当的抗氧化活性、良好的稳定性，并能促进益生菌生长，在食品和营养保健领域具有应用前景。
