《Journal of Applied Poultry Research》：Oral selenium yeast supplementation enhances antiviral immunity in specific pathogen-free chicken challenged with infectious bronchitis virus
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硒酵母（Selenium yeast）具有多效性的免疫调节作用。本研究旨在探讨口服硒酵母补充对鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）感染后宿主免疫应答的影响。研究人员将60只1日龄无特定病原体（Specific
硒酵母（Selenium yeast）具有多效性的免疫调节作用。本研究旨在探讨口服硒酵母补充对鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）感染后宿主免疫应答的影响。研究人员将60只1日龄无特定病原体（Specific pathogen-free，SPF）鸡随机分为硒酵母组和对照组。硒酵母组鸡只每日口服一次硒酵母，连续21天，目标补充硒水平相当于0.2 mg Se/kg饲粮（100 mg硒酵母/kg饲粮；产品硒含量为2,000 mg/kg），对照组鸡只接受等体积灭菌水。补充持续至IBV攻毒当日。21日龄时，所有鸡只接受低致病性IBV毒株CK/CH/I0317/22攻毒。两组间临床体征和生长性能无显著差异。然而，硒酵母补充与感染后16–24天（days post-infection，dpi）血清IBV特异性抗体水平升高及24 dpi时病毒脱落减少相关。此外，硒酵母补充与IBV感染鸡肝脏和脾脏中病毒载量降低相关。在转录水平上，硒酵母补充与多个组织中部分抗氧化相关基因（包括GSH-Px1、GSH-Px2和GSH-Px3）mRNA水平升高相关。相反，补充改变了部分先天性和适应性免疫相关基因的mRNA水平，包括禽β-防御素（AvBD1、AvBD2、AvBD6、AvBD8和AvBD14）、细胞因子（白细胞介素-1β [IL-1β]、IL-6和干扰素-γ [IFN-γ]）、髓样分化因子88（MyD88）、含TIR结构域衔接蛋白诱导干扰素-β（TRIF）、Toll样受体（TLR3、TLR7、TLR15和TLR21）、CD4和CD8，且呈现组织和时间依赖性。总之，硒酵母补充与增强的IBV特异性抗体应答、感染晚期病毒脱落减少、肝脏和脾脏病毒载量降低以及抗氧化和免疫相关基因转录的调节相关。这些发现为硒酵母在IBV感染期间的潜在免疫调节作用提供了进一步见解，并支持将其作为家禽病毒性疾病管理的营养辅助手段加以考虑，但其功能有效性仍需进一步验证。
论文解读：硒酵母口服补充增强传染性支气管炎病毒攻毒SPF鸡的抗病毒免疫
一、研究背景与科学问题
传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）是最早被鉴定和表征的冠状病毒之一，已在全球流行近一个世纪，持续对家禽健康构成威胁。IBV感染对肉鸡生长产生不利影响，降低蛋鸡和肉种鸡的产蛋量，并可能造成不同程度的死亡率。此外，感染鸡对大肠杆菌等继发性细菌感染的易感性增加，导致重大经济损失。疫苗接种是目前IBV防控的主要策略。然而，与其他冠状病毒相似，IBV是一种正链单股RNA病毒，由于缺乏校对机制，通过遗传漂变和基因重配持续发生抗原进化，导致疫苗效力降低。同时，抗病毒药物的使用受到病毒耐药性、药物残留和食品安全等问题的限制。因此，迫切需要经济有效的策略来增强针对IBV感染的免疫保护。
先天免疫系统通过模式识别受体感知病原体相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）和危险相关分子模式（Danger-associated molecular patterns，DAMPs），最终影响炎症性疾病的结果。IBV作为典型的病毒PAMP，可诱导氧化应激、内质网应激和炎症反应，激活多种细胞死亡途径，最终导致肾脏或呼吸道病变。I型干扰素（Interferons，IFNs）和促炎细胞因子与组织病理损伤的发展有关。当细胞因子风暴发生时，促炎细胞因子水平过度升高，导致炎症病变。因此，维持免疫稳态是增强宿主抵御病原体免疫防御、从而抑制病毒感染的有效策略。
硒于1817年首次被发现，最初被认为是有毒元素，1957年其在哺乳动物中的有益作用被报道。此后，硒被证明在中枢神经系统、雄性生殖生物学、肌肉功能、心血管健康、免疫和抗氧化功能中发挥重要作用。近年来，其抗病毒潜力日益受到关注。高水平的硒补充可通过促进先天免疫细胞功能（包括吞噬细胞和自然杀伤细胞活性）以及调节白细胞介素产生来增强抗病毒应答，从而影响Th1/Th2应答。相反，硒缺乏会损害中性粒细胞和腹腔巨噬细胞杀灭病原体的能力，并增加促炎细胞因子（包括肿瘤坏死因子-α [TNF-α]、IL-1β和IL-6）的分泌，可能增加感染部位的炎症易感性。
作为家禽营养中广泛使用的有机硒源，硒酵母在代谢途径和组织滞留方面不同于无机硒源。硒代蛋氨酸是硒酵母的主要含硒成分，可替代蛋氨酸掺入组织蛋白，建立可在蛋白质周转过程中动员的硒储备。以亚硒酸钠形式提供的硒可支持硒蛋白合成，但不通过蛋氨酸替代进入该储存库。在家禽流感模型中，膳食硒已被证明可影响抗病毒免疫应答。例如，硒酵母可提高针对低致病性禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）H9N2亚型甲醛灭活疫苗的免疫原性和保护效力，并在接种H9N2疫苗的鸡中诱导更高滴度的IgM和IgY。这些发现提示硒酵母可增强宿主抗病毒防御。因此，研究人员假设硒酵母补充可增强IBV感染SPF鸡的免疫保护，并据此开展本研究。
二、研究设计与主要技术方法
本研究首先通过剂量筛选实验确定最佳硒酵母补充剂量。80只1日龄SPF白来航鸡随机分为四组，分别以0、0.1、0.2、0.3 mg Se/kg饲粮水平口服硒酵母至21日龄，随后进行IBV攻毒，在攻毒后2和7天（days post-infection，dpi）检测各组织病毒载量。结果显示0.2 mg Se/kg饲粮剂量在降低组织病毒载量方面效果最为显著，故选择该剂量进行后续实验。
正式实验中，60只1日龄SPF鸡随机分为硒酵母组和对照组（每组30只），分别饲养于独立单层隔离器中。硒酵母组每日口服新鲜配制的硒酵母（以0.2 mL灭菌水配制），目标补充硒水平相当于0.2 mg Se/kg饲粮，即100 mg硒酵母/kg饲粮，相当于每日1.4、1.7和2.3 mg硒酵母/只（分别对应2.8、3.4和4.6 μg Se/只/天），连续21天。对照组按相同时间表接受0.2 mL灭菌水。21日龄时，所有鸡只通过眼鼻途径接种100 μL滴度为107.0 EID50/mL的IBV毒株CK/CH/I0317/22（GI-19 [QX-like]谱系），即每只鸡106.0 EID50。攻毒后，每组10只标记鸡持续观察临床体征至24 dpi，并于4、8、12、16、20和24 dpi采集翅静脉血和口咽拭子。另每组10只鸡分别于2和7 dpi安乐死，采集气管、肝脏、肾脏、脾脏、盲肠扁桃体和法氏囊组织。主要技术方法包括：酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测IBV特异性抗体；逆转录定量PCR（Reverse transcription-quantitative PCR，RT-qPCR）检测口咽拭子和组织中的病毒载量及脱落；RT-qPCR检测抗氧化相关基因（GSH-Px1、GSH-Px2、GSH-Px3）、Toll样受体（TLR3、TLR7、TLR15、TLR21）、禽β-防御素（AvBD1、AvBD2、AvBD6、AvBD8、AvBD14）、炎性细胞因子（IL-6、IL-1β）、Th1型细胞因子（IFN-γ）、MyD88、TRIF、CD4和CD8的mRNA表达水平，以18S rRNA为参考基因。统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey多重比较检验，以个体鸡为观测单位，P < 0.05为差异显著标准。
三、研究结果
1. 硒酵母补充剂量的确定
在初步剂量筛选实验中，硒酵母补充与病毒载量的剂量、组织和时间依赖性变化相关。与对照组相比，0.1 mg Se/kg剂量组在2 dpi时盲肠扁桃体病毒载量显著降低；0.2 mg Se/kg剂量组在2和7 dpi时肝脏和脾脏病毒载量均显著降低；0.3 mg Se/kg剂量组在7 dpi时法氏囊病毒载量显著降低。在所测剂量中，0.2 mg Se/kg剂量组在所检组织和时间点中显示出最显著的整体病毒载量降低效果，故选择该剂量进行后续攻毒实验。
2. 口服硒酵母补充对IBV感染鸡生长性能、临床体征和组织病理学病变的影响
在攻毒前（1–21天）和攻毒后（21–45天）两个时期，硒酵母组与对照组在平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和饲料转化率（FCR）方面均无显著差异。两组临床体征均始于4 dpi，表现为轻微咳嗽和频繁甩头，至14 dpi逐渐消退，16 dpi完全消失，两组间临床体征的发生、进展和消退无明显差异。气管和肾脏中观察到单核细胞浸润，但目视检查显示两组组织病理学表现相似。组织病理学结果仅作描述性评估，未进行定量病变评分或统计比较。
3. 口服硒酵母补充对IBV感染鸡IBV特异性抗体水平和病毒脱落的影响
ELISA检测结果显示，对照组IBV特异性抗体水平从4至12 dpi持续升高，12 dpi后进入平台期并维持至24 dpi。硒酵母组抗体水平从4至16 dpi持续升高，并在24 dpi前维持较高水平。值得注意的是，硒酵母组在感染后期（16–24 dpi）抗体水平显著高于对照组（P < 0.05）。口咽拭子病毒脱落检测显示，在4、8、12、16和20 dpi时两组间无显著差异，但在24 dpi时对照组出现病毒脱落反弹升高，而硒酵母组病毒脱落显著受抑且低于对照组（P < 0.05）。
4. 口服硒酵母补充对IBV感染鸡组织病毒载量的影响
RT-qPCR检测显示，IBV感染鸡的所有被检组织（肝脏、脾脏、法氏囊、盲肠扁桃体、肾脏和气管）中均可检测到病毒，对照组气管病毒拷贝数最高。在7 dpi时，硒酵母组肝脏和脾脏的病毒拷贝数显著低于对照组（P < 0.05），提示硒酵母补充可能通过抑制病毒复制增强鸡的免疫力，但未在所有器官中实现完全病毒清除。
5. 口服硒酵母补充对IBV感染鸡抗氧化能力的影响
硒酵母组多个组织中GSH-Px1、GSH-Px2和GSH-Px3的mRNA水平在2和/或7 dpi时高于对照组，但模式因基因、组织和采样时间点而异（P < 0.05）。GSH-Px1 mRNA水平在2 dpi时除肝脏、盲肠扁桃体和气管外的大多数组织中显著升高；GSH-Px2 mRNA水平在2 dpi时除肝脏、盲肠扁桃体和肾脏外的大多数组织中显著升高，7 dpi时法氏囊除外；GSH-Px3 mRNA水平在7 dpi时盲肠扁桃体、肾脏和气管中显著升高，脾脏在2和7 dpi时均显著升高（P < 0.05）。
6. 口服硒酵母补充对IBV感染鸡免疫功能的影响
硒酵母组多个组织中AvBD基因（AvBD1、AvBD2、AvBD6、AvBD8和AvBD14）的mRNA表达水平在2或7 dpi时低于对照组（P < 0.05），各亚型呈现组织和时间特异性显著下调模式。细胞因子方面，IL-1β mRNA水平在2 dpi时肝脏和脾脏中较低；IL-6水平仅在2 dpi时盲肠扁桃体中较低；IFN-γ mRNA水平在2 dpi时法氏囊中、7 dpi时盲肠扁桃体中、以及2和7 dpi时肝脏和脾脏中均较低（P < 0.05）。硒酵母组MyD88 mRNA水平在2 dpi时肝脏和肾脏中、2和7 dpi时气管中显著较低；TRIF水平仅在2 dpi时肝脏中显著较低（P < 0.05）。TLR方面，TLR3 mRNA水平仅在7 dpi时法氏囊中较低，TLR7水平在2 dpi时法氏囊和盲肠扁桃体中较低，TLR15水平仅在7 dpi时肾脏中较低，TLR21水平在2 dpi时肝脏和气管中较低（P < 0.05）。CD4 mRNA水平在7 dpi时法氏囊中、2和7 dpi时肝脏和脾脏中显著较低；CD8 mRNA水平在2 dpi时脾脏、肾脏和气管中显著较低，但7 dpi时脾脏中较高（P < 0.05）。
四、讨论与结论
本研究表明，硒酵母补充未在现有实验条件下产生可检测的IBV感染临床病程改善。硒酵母补充增强了16–24 dpi的IBV特异性抗体应答，降低了24 dpi的病毒脱落以及IBV感染鸡肝脏和脾脏中的病毒载量，但在早期采样时间点未检测到病毒脱落的显著组间差异，表明该效应仅限于IBV感染晚期。硒酵母补充与IBV感染鸡部分抗氧化相关基因mRNA水平升高相关，提示硒酵母可能通过调节抗氧化防御相关转录应答影响IBV感染进程。硒酵母补充改变了部分先天免疫相关基因（包括炎性细胞因子、AvBDs和TLR相关基因）的mRNA水平，这些mRNA水平的协调下调以及CD4和CD8基因表达的变化，提示硒酵母可能在IBV感染期间调节炎症和免疫相关转录应答。
研究存在若干局限性：缺乏年龄匹配的未攻毒对照组，无法完全区分发育变化、硒酵母直接效应和硒×IBV交互作用；组织测量取自不同时间点安乐死的不同鸡只，未建模处理和时间点的主效应及交互作用；重复测量的抗体和病毒脱落数据未建模鸡内相关性；隔离器水平未设置重复。总体而言，硒酵母补充与增强的IBV特异性抗体应答、24 dpi病毒脱落减少以及抗氧化防御和先天免疫相关基因mRNA水平改变相关。这些发现支持硒酵母作为IBV感染期间膳食免疫调节补充剂的潜在应用，但其实际功效和生物学机制需通过蛋白水平、功能性和田间研究进一步验证。
