**超高龄急性髓系白血病接受低强度治疗患者中FLT3-ITD微克隆的临床与分子特征**

《Leukemia》：Clinical and molecular characteristics of FLT3-ITD microclones in elderly patients with acute myeloid leukemia receiving less-intensive therapy

　　

FMS样酪氨酸激酶3（FLT3）的内部串联重复（ITD）在所有新诊断的急性髓系白血病（AML）病例中检出率高达30%，在老年患者中患病率随年龄下降。FLT3-ITD阳性的AML患者预示不良预后和较短的中位总生存期（OS），根据ELN 2024低强度治疗评分对应中等遗传学风险分类。已有有前景的新研究探讨将低甲基化药物（HMA）、维奈克拉和靶向FLT3抑制剂联合的三药方案用于不适合强化疗的FLT3-ITD阳性患者。值得关注的是，近期在适合强化疗、经传统片段长度分析判定为FLT3-ITD阴性的年轻AML患者中，高达25%可检出FLT3-ITD微克隆（定义为等位基因比率（AR）< 0.05）。FLT3-ITD微克隆与NPM1和DNMT3A突变共存，并与NPM1突变型年轻AML患者较差的無復發生存（RFS）及较高的可测量残留病（MRD）水平相关。目前，FLT3-ITD微克隆在老年、不适合强化疗患者中的发生率及预后影响尚不明确。鉴于FLT3-ITD微克隆在年轻队列中的预后相关性及其潜在治疗意义，研究人员旨在评估FLT3-ITD微克隆在老年个体中的影响。本研究纳入201年初诊时年龄≥65岁的201例AML患者：患者于2006年至2026年间在本机构接受一线低强度治疗或最佳支持治疗（BSC），且初诊时片段长度分析为FLT3-ITD阴性、AR < 0.05（补充图S1）。诊断时中位年龄为76岁（范围65–90），125例患者为男性（62%）。95例（47.3%）接受HMA单药治疗，67例（33.3%）接受HMA联合治疗（+维奈克拉[n = 62]/艾伏尼布[n = 5]），38例（18.9%）仅接受最佳支持治疗（BSC），1例（0.5%）治疗数据不完整。所有患者初诊时均行靶向超高灵敏度纠错下一代测序（NGS）和毛细管电泳片段长度分析，方法如前所述。NGS检测FLT3-ITD采用三种不同方法以提高敏感性和特异性：开源算法filt3r、getITD及自定义脚本。NGS髓系panel和细胞遗传学分析按既往描述进行。本研究超灵敏NGS检测的中位测序深度为每样本161.392 reads（范围51.629–474.239）。201例患者中21例（10.4%）初诊时检出FLT3-ITD微克隆，中位VAF为0.035%（范围0.007–1.153%）（补充图S2）。21例中16例（76.2%）携带单个FLT3-ITD插入，2例（9.5%）有2个FLT3-ITD插入，3例（14.3%）有3至5个FLT3-ITD插入。插入长度为6至102个核苷酸，中位插入长度33个核苷酸。将超灵敏NGS结果与片段长度分析比较，NGS识别的21个FLT3-ITD微克隆中仅6个（28.5%）被片段长度分析检出，AR低于0.05。值得注意的是，两种方法均检出的FLT3-ITD微克隆VAF较高，中位为0.617%（范围0.023–1.153%），而片段分析漏检的微克隆较小，中位VAF为0.031%（范围0.007–0.293）。与无FLT3-ITD微克隆的患者相比，携带FLT3-ITD微克隆的患者诊断时白细胞（WBC）计数显著更高（23.9 vs. 6.95 10⁹/l，p = 0.027），而血红蛋白（9 vs. 8.9 10⁹/l，p = 0.517）和血小板（67 vs. 47.5 10⁹/l，p = 0.502）无差异（表1）。年龄、性别和AML类型无显著差异。根据ELN 2024低强度治疗患者分类，与无FLT3-ITD微克隆的患者相比，携带FLT3-ITD微克隆的患者更多被归为中等风险（38.1% vs. 17.2%），较少归为不良风险（0% vs 25%）（p = 0.019）。细胞遗传学分析显示，与无FLT3-ITD微克隆者相比，携带FLT3-ITD微克隆者复杂异常核型发生率呈降低趋势，但差异无统计学意义（4.8% vs 27.8%，p = 0.068）。分子共突变评估显示，携带FLT3-ITD微克隆者TP53突变频率呈降低趋势（0% vs. 25.6%，p = 0.11）。此外，研究人员未在FLT3-ITD微克隆队列中检出更高的NPM1突变频率（10% vs. 13.6%，p = 0.817）。然而，携带FLT3-ITD微克隆的患者DNMT3A（p = 0.02）、SMC3（p = 0.02）和NRAS（p = 0.03）突变患病率显著更高，BCOR突变数量增加（n = 0.16）（表1，图1A）。图1：FLT3-ITD微克隆的遗传学格局与预后影响。A 比较FLT3-ITD微克隆阳性与阴性患者之间的突变格局。1例FLT3-ITD微克隆阳性和4例FLT3-ITD微克隆阴性患者髓系panel数据缺失。B FLT3-ITD微克隆阳性与阴性患者之间的总生存期（OS）。表1 携带或不携带FLT3-ITD微克隆的老年AML患者基线特征。研究人员随后在接受非强化治疗的老年AML患者中研究了FLT3-ITD微克隆的预后影响，尤其考虑到现行ELN低强度治疗风险分类将FLT3-ITD阳性视为不良分类因素。在整个组中，携带与不携带FLT3-ITD微克隆的患者总生存期（OS）无差异（p = 0.97）（图1B）。然而，在仅接受BSC的患者中，携带FLT3-ITD微克隆者OS显著短于FLT3-ITD阴性患者（HR 2.8，CI 1.006–7.808，p = 0.04）（补充图S3A）。在接受HMA单药治疗（p = 0.64）或HMA为基础联合治疗（p = 0.68）的患者中未观察到这一OS差异（补充图S3B–D）。为刻画FLT3-ITD微克隆的克隆演化，研究人员分析了7例FLT3-ITD微克隆阳性患者治疗期间不同时间点的可用随访样本（补充图S2、S4）。1例患者（患者20）经4个周期阿扎胞苷联合维奈克拉治疗后达完全缓解，并在缓解时丢失FLT3-ITD微克隆。另一例患者（患者15）在地西他滨治疗两年后出现外周原始细胞再现，FLT3-ITD微克隆克隆从1.15%扩增至9.52%。2例携带0.029%（患者8）和0.0074%（患者6）微小FLT3-ITD微克隆的患者，分别经1个和8个周期HMA单药治疗后疾病难治并丢失微克隆，而另3例（患者17、16和14）难治性疾病患者经≤4个周期HMA为基础治疗后出现FLT3-ITD微克隆扩增。研究人员随后采用超高清NGS评估初判为FLT3-ITD微克隆阴性的患者在复发或难治（R/R）疾病时是否获得FLT3-ITD突变。在19例有可用R/R样本的初判FLT3-ITD微克隆阴性患者中，R/R疾病期间未出现可检出的FLT3-ITD突变。综上，本研究采用超高清NGS在接受低强度治疗的老年AML患者中检出10.4%的FLT3-ITD微克隆，这些患者此前被传统片段长度分析判定为FLT3-ITD阴性。FLT3-ITD微克隆患者比例低于年轻、强化治疗患者的报道，与老年AML患者FLT3-ITD突变患病率较低相一致。片段长度分析仅检出这些微克隆的28.5%，且AR均< 0.05，进一步证实NGS识别小FLT3-ITD克隆的敏感性更高。与FLT3-ITD阴性患者相比，携带FLT3-ITD微克隆的老年AML患者TP53突变发生率呈降低趋势，且较少被归为ELN不良风险。此外，微克隆阳性患者复杂核型患病率较低，提示其具有独特的生物学背景，与继发性、既往存在的髓系疾病的关联弱于老年患者中通常所见。值得关注的是，研究人员未发现FLT3-ITD微克隆与NPM1突变之间的关联，尽管该关联曾在接受强化疗的年轻AML患者的FLT3-ITD微克隆中有报道。然而，既往描述的与DNMT3A共存现象在本老年FLT3-ITD微克隆阳性队列中亦观察到。此外，研究人员识别出FLT3-ITD微克隆与NRAS（另一参与信号转导的基因）突变之间的关联，此关联在年轻AML患者中尚未被描述。初诊时较高的WBC计数和仅接受BSC患者较差的OS提示携带FLT3-ITD微克隆的老年AML患者具有更强的增殖表型，突显了即使小的FLT3-ITD克隆亦具增殖增强潜力。然而，HMA为基础的治疗似可减轻这些OS差异，提示FLT3-ITD微克隆的预后影响小于大克隆，正如ELN 2024推荐所反映。多数FLT3-ITD微克隆在R/R疾病期间持续存在，部分出现克隆扩增，而VAF < 0.1%的微克隆偶可丢失，即使在难治性疾病中亦然。初诊时NGS评估为FLT3-ITD阴性的患者无一在R/R疾病时获得FLT3-ITD突变，提示复发时的FLT3-ITD突变主要起源于预先存在的亚克隆。本研究受限于FLT3-ITD微克隆患者数量较少（反映该亚组的罕见性），以及接受HMA联合维奈克拉治疗的患者数量有限。需在更大队列中进一步研究，以更好理解耐药机制和克隆演化，并评估FLT3-ITD监测在初诊检出FLT3-ITD微克隆的非强化治疗患者中早期发现治疗耐药的潜在作用。FLT3抑制剂治疗在FLT3-ITD微克隆患者中的临床意义尚不明确。在携带FLT3-ITD突变的年轻患者中，强化疗加用FLT3抑制剂已被证明可改善结局，不论AR和克隆大小。此外，QUIWI试验显示，即使在被视为FLT3-ITD阴性的患者中，quizartinib治疗亦具更优结局。随后的亚组分析显示，在FLT3-ITD微克隆阳性患者中，quizartinib治疗有延长缓解持续时间的非显著趋势。总之，本研究数据表明，FLT3-ITD微克隆发生于相当比例的老年、不适合强化疗的AML患者中，代表一种更具增殖性的AML类型，并显示独特的突变模式。在本研究中，FLT3-ITD微克隆在接受标准治疗的老年患者中无预后意义。然而，需更大规模研究验证此发现，并阐明靶向联合治疗在该患者群体中是否发挥作用。

**一、研究背景与问题**

FMS样酪氨酸激酶3（FLT3）内部串联重复（ITD）突变见于高达30%的新诊断急性髓系白血病（AML）病例，但在老年患者中患病率随年龄下降。FLT3-ITD阳性预示不良预后和较短的中位总生存期（OS），按ELN 2024低强度治疗评分属中等遗传学风险。近年有前景的研究探索低甲基化药物（HMA）、维奈克拉与靶向FLT3抑制剂联合的三药方案用于不适合强化疗的FLT3-ITD阳性患者。值得关注的是，近期在适合强化疗、经传统片段长度分析判为FLT3-ITD阴性的年轻AML患者中，高达25%可检出FLT3-ITD微克隆（定义为等位基因比率（AR）< 0.05），此类微克隆与NPM1、DNMT3A突变共存，并与NPM1突变型年轻患者较差的無復發生存（RFS）及较高可测量残留病（MRD）水平相关。然而，FLT3-ITD微克隆在老年、不适合强化疗患者中的发生率与预后影响尚不明确。鉴于其在年轻队列中的预后相关性及潜在治疗意义，研究人员旨在评估FLT3-ITD微克隆在老年个体中的影响。

**二、研究开展与结论**

本研究纳入201例初诊年龄≥65岁的AML患者，患者于2006至2026年间在本机构接受一线低强度治疗或最佳支持治疗（BSC），初诊时片段长度分析为FLT3-ITD阴性且AR < 0.05。中位年龄76岁（范围65–90），125例（62%）为男性。95例（47.3%）接受HMA单药，67例（33.3%）接受HMA联合治疗（+维奈克拉[n = 62]/艾伏尼布[n = 5]），38例（18.9%）仅接受BSC，1例（0.5%）治疗数据不完整。研究人员得出：超高清NGS在10.4%的此类患者中检出FLT3-ITD微克隆，其比例低于年轻强化治疗患者；微克隆患者具有独特的突变模式，表现为更具增殖性的表型；在接受标准治疗的老年患者中微克隆无预后意义，但在仅接受BSC者中预后较差。其重要意义在于揭示了FLT3-ITD微克隆在老年人群中的流行病学与生物学特征，为NGS敏感性优势及靶向治疗在该人群中的潜在价值提供了依据。

**三、主要关键技术方法**

研究人员对全部患者初诊样本行靶向超高灵敏度纠错下一代测序（NGS）（中位测序深度161.392 reads/样本，范围51.629–474.239）及毛细管电泳片段长度分析。NGS检测FLT3-ITD采用三种方法以提升敏感性与特异性：开源算法filt3r、getITD及自定义脚本。此外行NGS髓系panel与细胞遗传学分析。样本队列来自本机构2006至2026年间收治的201例老年AML患者。

**四、研究结果**

（1）FLT3-ITD微克隆的检出与分子特征：201例中21例（10.4%）初诊检出微克隆，中位VAF 0.035%（范围0.007–1.153%）；16例（76.2%）为单个插入，2例（9.5%）2个，3例（14.3%）3–5个；插入长度6–102个核苷酸，中位33个。与片段长度分析比较，仅6个（28.5%）微克隆被检出且AR均< 0.05；两种方法均检出者VAF较高（中位0.617%，范围0.023–1.153%），漏检者较小（中位0.031%，范围0.007–0.293）。由此表明NGS识别小FLT3-ITD克隆的敏感性显著更高。

（2）基线特征比较：微克隆阳性者诊断时白细胞（WBC）计数显著更高（23.9 vs. 6.95 10⁹/l，p = 0.027），血红蛋白（9 vs. 8.9 10⁹/l，p = 0.517）与血小板（67 vs. 47.5 10⁹/l，p = 0.502）无差异；年龄、性别及AML类型无显著差异。按ELN 2024低强度治疗分类，阳性者更多归为中等风险（38.1% vs. 17.2%）、较少归为不良风险（0% vs 25%）（p = 0.019）。复杂异常核型发生率呈降低趋势（4.8% vs 27.8%，p = 0.068），TP53突变频率呈降低趋势（0% vs. 25.6%，p = 0.11）。NPM1突变频率无升高（10% vs. 13.6%，p = 0.817），但DNMT3A（p = 0.02）、SMC3（p = 0.02）、NRAS（p = 0.03）突变患病率显著更高，BCOR突变数量增加（n = 0.16）。由此提示微克隆阳性患者具有独特生物学背景及更强增殖表型。

（3）预后影响：全组中微克隆阳性与阴性者OS无差异（p = 0.97）；但在仅接受BSC者中，阳性者OS显著更短（HR 2.8，CI 1.006–7.808，p = 0.04）；HMA单药（p = 0.64）或HMA为基础联合治疗（p = 0.68）者未见此差异。由此表明微克隆的预后影响仅在不治疗时显现，HMA为基础治疗可减轻该差异。

（4）克隆演化：对7例阳性患者随访样本分析显示，患者20经4周期阿扎胞苷联合维奈克拉达完全缓解并丢失微克隆；患者15经地西他滨治疗两年后原始细胞再现，克隆由1.15%扩增至9.52%；患者8（0.029%）与患者6（0.0074%）在难治后丢失微克隆；患者17、16、14在≤4周期HMA为基础治疗后出现微克隆扩增。19例初判阴性且有R/R样本者中无一在R/R时出现可检出FLT3-ITD突变。由此提示多数微克隆在R/R期间持续存在、部分扩增，而极小克隆偶可丢失，复发时FLT3-ITD突变主要起源于预先存在的亚克隆。

**五、讨论与结论**

讨论指出：老年低强度治疗患者中微克隆比例低于年轻强化治疗者，与老年AML中FLT3-ITD患病率较低一致；片段分析仅检出28.5%的微克隆，证实NGS敏感性更高。微克隆阳性者TP53突变与复杂核型发生较少、较少归为ELN不良风险，提示其与继发性髓系疾病的关联较弱。与年轻患者不同，本研究未发现微克隆与NPM1突变的关联，但亦观察到与DNMT3A共存，并新发现与NRAS突变的关联。初诊较高WBC及仅BSC者较差OS提示更具增殖性的表型，而HMA为基础治疗可减轻OS差异，提示微克隆预后影响小于大克隆。多数微克隆在R/R期间持续存在、部分扩增，VAF < 0.1%者偶可丢失；初诊NGS阴性者R/R时未获得FLT3-ITD突变，提示复发时突变主要源于预先存在的亚克隆。研究局限包括微克隆患者数量少及接受HMA联合维奈克拉者有限；需更大队列验证并评估FLT3-ITD监测的潜在作用，FLT3抑制剂在微克隆患者中的临床意义仍不明确；年轻患者中强化疗加用FLT3抑制剂可改善结局而不论AR与克隆大小，QUIWI试验显示quizartinib在判为FLT3-ITD阴性者中亦具优势，亚组分析提示微克隆阳性者有延长缓解持续时间的非显著趋势。

研究结论（译）：总之，本研究数据表明，FLT3-ITD微克隆发生于相当比例的老年、不适合强化疗的AML患者中，代表一种更具增殖性的AML类型，并显示独特的突变模式。在本研究中，FLT3-ITD微克隆在接受标准治疗的老年患者中无预后意义。然而，需更大规模研究验证此发现，并阐明靶向联合治疗在该患者群体中是否发挥作用。