Gαs N端螺旋（αN）的旋转触发Gα激活：一条αN驱动的GDP释放新途径

《Nature Chemical Biology》：Rotation of the N-terminal helix triggers Gα activation

　　

异源三聚体G蛋白（heterotrimeric G proteins）由G蛋白偶联受体（GPCR）激活，是细胞信号传导的核心介质。激活要求Gα亚基释放GDP，这一步骤主要归因于C端α5螺旋，即与GPCR相互作用的主要区域，而其他Gα区域的贡献仍不清楚。研究人员在此表明，Gαs的N端螺旋（αN）通过旋转构象变化促进GDP释放。X射线衍射追踪（DXT，diffracted X-ray tracking）显示，与活性GPCR的结合增加了αN的构象位移。生化实验和分子动力学（MD，molecular dynamics）模拟显示，从细胞外一侧观察时，αN的逆时针（CCW，counterclockwise）旋转促进GDP释放，而顺时针旋转则无此效应。在机制上，这一αN介导的通路与α5构象变化协同作用，并通过Ras同源域（RHD，Ras homology domain）内的β-片层网络传播至P-loop（phosphate-binding loop，磷酸结合环）和αG螺旋。这些发现确定了一条由αN驱动的激活通路，并拓展了GPCR触发G蛋白激活的机制框架。

**研究背景**

异源三聚体G蛋白由G蛋白偶联受体（GPCR）激活，是介导神经递质传导、激素分泌和免疫反应等多样生物过程的核心介质。Gα蛋白分为Gαs、Gαi、Gαq和Gα12四个亚家族，通过共同机制激活：与活化GPCR结合后发生GDP/GTP交换，由失活的GDP结合态转变为活化的GTP结合态，进而作用于下游效应分子。由于GDP释放是Gα激活的限速步骤，阐明其分子机制对理解G蛋白信号转导至关重要。既往比较失活态与GPCR结合的无核苷酸活性态结构，已鉴定出α5螺旋、α-螺旋域（AHD，α-helical domain）、β6–α5 loop和P-loop等关键构象变化，其中α5的作用被特别强调，被认为通过促进AHD打开及GDP结合环重排来推动GDP释放。然而，α5以外区域在激活中的贡献仍不清楚；氢氘交换质谱分析提示，激活在α5与受体核心深度结合之前即已发生，意味着其他Gα区域同样参与激活过程。Gα的N端螺旋（αN）与GPCR的胞内环（ICL，intracellular loop）相互作用，且缺失αN会损害视紫红质激活时的核苷酸交换而不影响Gβγ结合；既往提出的αN–ICL2相互作用诱导β1片层与P-loop变化从而促进GDP释放的假说，未经严格验证，因果关系不明确。这构成了本研究要解决的核心问题。

**研究开展、结论与意义**

研究人员综合运用X射线衍射追踪（DXT）、结构信息学分析、NanoBiT分裂荧光素酶检测、分子动力学（MD）模拟及定点交联-核苷酸释放实验，证明Gαs的αN通过逆时针（CCW）旋转促进GDP释放，并揭示该αN介导通路与α5介导通路协同汇聚于GDP结合位点。成果发表于《Nature Chemical Biology》，确立了此前未被认识的αN驱动激活途径，完善了GPCR触发G蛋白激活的机制框架。

**主要技术方法**

研究人员主要采用四项关键技术：一是X射线衍射追踪（DXT，diffracted X-ray tracking）与X射线闪烁（DXB，diffracted X-ray blinking），将金纳米晶标记于Gs异三聚体的αN并追踪亚毫秒级角度位移，以解析αN旋转运动；二是NanoBiT分裂荧光素酶互补检测，分别定量G蛋白解离与GPCR–G蛋白结合；三是分子动力学（MD，molecular dynamics）模拟与刚性传输别构分析（RTA，rigidity transmission allostery），并结合DTME双半胱氨酸交联固定αN构象、以BODIPY-GDP实验验证GDP释放。样本方面，Gαs与Gβγ异二聚体表达纯化自Sf9昆虫细胞，去酰基的最小半胱氨酸Gαs及突变体纯化自大肠杆菌，Gs偶联受体β3AR表达自HEK293S GnTI?细胞；结构分析基于53个非冗余GPCR–Gs复合物的实验结构。

**研究结果**

**活性GPCR结合触发αN的旋转运动**

DXT实验中，GDP结合的Gs异三聚体经Gγ亚基His标签固定于基底，αN表面高暴露的Met1^HN.01与Cys3^HN.09被金纳米晶标记。结果显示，仅在与激动剂结合的β3AR存在时，χ方向均方位移（MSD，mean squared displacement）在100–200 μs早期时间点显著增强，而θ方向无明显变化。DXB分析显示，M1^HN.01S/C3^HN.09S突变体的衍射强度降至约一半，快速动态成分明显减少，证实DXT检测到的快速动态主要来自αN标记的金纳米晶，即活性GPCR结合选择性增强了αN的旋转运动。

**αN在GPCR–Gs复合物中的结构变化**

研究人员整合377个实验解析的活性态GPCR–Gs结构，按每种受体选取最高分辨率结构，构建53个非冗余复合物。以Ras同源域（RHD，Ras homology domain）对齐后，按αN残基16^HN.33与39^hns1.03的Cα原子连线定义Z轴，发现所有活性结构中16^HN.33的Cα原子相对于失活Gs结构位于左上方位，表明αN相对于Gα核心发生了旋转位移。

**αN调节G蛋白解离而非GPCR结合**

对53个复合物中αN–GPCR界面的分析发现，G.hns1区域的Arg38^hns1.02与Ala39^hns1.03参与界面相互作用，且hns1.02/03位在各Gα亚家族中多保守带正电的氨基酸。R38^hns1.02A突变使β3AR、β2AR、D1R和5-HT4激活导致的Gα–Gβ解离水平下降，而A39^hns1.03R突变升高所有受体的解离反应；两种突变体对GPCR–Gα结合的影响与野生型相当，表明αN的G.hns1区域特异性参与G蛋白解离（核苷酸交换）步骤。

**αN的逆时针旋转促进GDP释放**

膜环境β2AR–Gs复合物的900 ns MD模拟显示，在一条发生核苷酸释放的轨迹中，αN于GMP释放前约400–550 ns发生CCW位移，与AHD打开、RHD–AHD铰链F68^h1ha.04与αN的V36^HN.53相互作用形成同步发生。进一步的约束模拟对AHD截短单体Gαs施加αN方向约束并联合β6–α5约束：αN末端E16^HN.33在CCW与顺时针（CW，clockwise）条件下均位移约30 ?，但仅CCW约束在10次模拟中6次显著增加GDP的r.m.s.d.并伴随P-loop r.m.s.d.升高。DTME交联实验表明，固定αN于CCW构象的V36^HN.53C/K216^s2s3.02C突变体在纳米盘及去膜条件下均增强GDP/BODIPY-GDP交换与BODIPY-GDP释放，且可被还原剂TCEP逆转；固定CW构象的K34^HN.51C/D240^h2s4.03C突变体无此效应，证实CCW旋转而非CW旋转促进GDP释放。

**αN的CCW运动重排β-片层与GDP结合位点**

对GDP r.m.s.d.移动平均超过1.0 ?的六条轨迹分析显示，αG螺旋上参与鸟嘌呤环结合的K293^s5hg.01与D295^HG.02侧链发生显著旋转翻转而远离鸟嘌呤环，N292^S5.07与A366^s6h5.03距离增大。β1/β4/β5片层网络分析表明，CCW条件下L43^S1.04的ψ角与L44^S1.05的φ角分布改变（β1扭曲），L43^S1.04（β1）–I245^S4.03（β4）距离增大、A243^S4.01（β4）–I288^S5.03（β5）距离减小，片层内疏水接触距离增大。RTA分析显示，CCW条件下αN/β1铰链41^S1.02的别构扰动定向传向β4（前约17%）和β5（前约30%），并进一步抵达αG螺旋（前约50%）与P-loop（前约35%），且传播模式依赖αN运动方向；CW条件下无此定向传播。研究据此提出，CCW旋转扭曲β1、改变片层间距并重组疏水网络，进而扰动GDP结合位点。

**讨论与结论**

讨论部分提出，Gαs激活时αN与受体ICL结合并沿膜平面CCW旋转，扭曲β1并使其远离β4、β5，重排β-片层接触网络：αG螺旋被推离GDP鸟嘌呤环，β1变化重排P-loop并削弱其与GDP磷酸基团的接触，共同促进GDP释放。该αN通路与α5通路协同：α5先被拉入受体核心，触发AHD打开、β6–α5 loop重排并破坏与β-片层网络的疏水接触，使其灵活性增加；随后αN与受体ICL接触并CCW旋转，进一步重排已被α5松动的网络并将结构变化传至鸟嘌呤结合位点，随后α5位移稳定无核苷酸复合物。鉴于αN（G.hns1）与β-片层残基在各Gα亚家族中高度保守，该机制可能是整个G蛋白家族的共有GDP释放机制。与小型GTP酶中GEF直接在核苷酸结合口袋附近扰动Switch元件或产生静电排斥不同，Gα中GEF结合位点与GDP结合位点空间分离，αN充当从受体界面向核苷酸口袋传递构象变化的桥梁。研究还提出两种可能的CCW驱动机制：其一，αN被受体固定而Gα核心相对于GPCR发生顺时针旋转，使αN相对于Gα其余部分呈CCW位移；其二，AHD打开伴随RHD–AHD铰链（α1–αA loop）向αN移动并与之结合，从而驱动αN的CCW运动。研究结论认为，DXT与MD数据鉴定了GPCR–G蛋白复合物形成中此前未被表征的步骤，解决了静态结构比较无法捕捉的构象转变，将结构方法尚未解析的GDP释放阶段纳入统一机制框架，完善了Gα激活模型。