《Scientific Reports》：Identification of ferroptosis-related key genes influencing synovitis development in osteoarthritis based on machine learning
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本研究旨在探讨铁死亡相关基因（ferroptosis-related genes, FRGs）在骨关节炎（osteoarthritis, OA）滑膜炎中的潜在作用。研究人员从GEO数据库获取32例OA患者和32例正常对照的滑膜组织样本，并分析以鉴定差异表达FR
本研究旨在探讨铁死亡相关基因（ferroptosis-related genes, FRGs）在骨关节炎（osteoarthritis, OA）滑膜炎中的潜在作用。研究人员从GEO数据库获取32例OA患者和32例正常对照的滑膜组织样本，并分析以鉴定差异表达FRGs。加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）鉴定了一个与OA显著相关的基因模块。为进一步优选候选基因，应用随机森林、支持向量机（support vector machine, SVM）和极端梯度提升（Extreme Gradient Boosting, XGBoost）三种机器学习方法，其中SVM模型表现出最佳预测性能。通过整合分析，CARS被鉴定为与OA滑膜炎相关的候选关键铁死亡相关基因。进一步免疫浸润分析显示，CARS表达与滤泡辅助性T细胞丰度呈显著正相关，提示OA滑膜组织中铁死亡相关代谢调控与免疫微环境改变之间可能存在关联。此外，竞争性内源RNA（competing endogenous RNA, ceRNA）网络分析表明，CARS可能受多种非编码RNA调控，暗示复杂的转录后调控格局。采用实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白质印迹（Western blot）分析的实验验证支持了生物信息学预测，即CARS在OA滑膜组织中mRNA和蛋白水平均升高。总体而言，本研究提供了一个基于生物信息学的框架，用于鉴定OA滑膜炎中的铁死亡相关基因特征，并提示CARS可能作为与OA中铁死亡和免疫调节相关的潜在候选生物标志物。仍需进一步功能研究以阐明其机制作用。
研究背景：骨关节炎（osteoarthritis, OA）是一种持续性关节疾病，主要特征为关节软骨退变、骨赘形成和滑膜炎发生，在老年人中常见并显著影响生活质量。滑膜位于关节囊内层，由疏松结缔组织构成，可产生和调节滑液，减少运动时骨间摩擦并提供关节营养。滑膜炎是OA关键病理特征之一，参与炎症反应、加重软骨降解、促进血管生成和疼痛，被视为潜在治疗靶点，但其确切作用仍在研究。铁死亡是铁依赖性程序性细胞死亡的特殊形式，以细胞内铁水平升高和脂质过氧化增强为特征，其形态、机制和分子通路不同于凋亡、坏死等。铁死亡与癌症、神经疾病、缺血再灌注损伤、肾损伤和血液病等相关。关节疾病中，铁死亡受到关注；类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）生物信息学研究鉴定GABARAPL1、DUSP1、JUN、MAPK8等FRGs为潜在诊断标志物和治疗靶点；铜死亡与RA免疫浸润相关并已建立诊断模型。然而，针对OA滑膜炎FRGs的系统研究仍少。已有研究显示OA关节组织铁蓄积、氧化应激和脂质过氧化升高，形成利于铁死亡的微环境；Yao et al. (2023)显示软骨细胞铁死亡促进OA软骨降解；但OA滑膜炎中特定FRGs及其与滑膜免疫微环境的关系尚未系统研究。开展本研究的理由包括：OA滑膜组织铁沉积和氧化应激形成利于铁死亡的微环境；铁死亡细胞释放损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs），包括HMGB1和脂质过氧化产物，可激活先天免疫并维持滑膜慢性炎症；OA滑膜免疫微环境受铁和脂质代谢影响；氨酰-tRNA合成酶包括CARS作为代谢传感器，连接翻译控制、免疫调节和细胞死亡敏感性。机器学习在OA研究中应用增多，可用于预测进展速度、疾病严重度、治疗反应及影像分析，但应用机器学习发现OA滑膜炎FRGs的研究仍少。因此，研究人员开展本研究以探索OA滑膜炎相关FRGs、鉴定与OA强相关基因模块，并探讨CARS在OA滑膜炎及免疫细胞浸润中的作用。研究人员整合GEO数据库中32例OA和32例正常滑膜样本，开展差异FRGs分析、WGCNA、三种机器学习筛选、免疫浸润分析、ceRNA网络分析和qRT-PCR/Western blot验证。结论为CARS是与OA滑膜炎相关的候选关键FRG，其表达与滤泡辅助性T细胞（follicular helper T cells, Tfh）浸润正相关，可能受非编码RNA调控，并在OA滑膜mRNA和蛋白水平升高。其意义在于提供基于生物信息学的OA滑膜炎FRGs识别框架，提示CARS可能作为与铁死亡和免疫调节相关的候选生物标志物，但仍需进一步功能研究。
主要关键技术方法：数据来自GEO数据库GSE55235（10例OA/10例正常）、GSE55457（10/10）和GSE46750（12/12），整合为64例样本；FRGs参考Ze-Xian Liu等研究确定的24个FRGs；采用limma进行差异分析、GO/KEGG富集、PCA和热图；采用WGCNA构建共表达模块；采用随机森林、SVM和XGBoost建模并以ROC/AUC评价；采用CIBERSORT反卷积分析22种免疫细胞浸润；采用ENCORI（StarBase）、miRTarBase和TargetScan预测并Cytoscape可视化ceRNA网络；临床滑膜组织来自海南医学院附属海南医院（海南省人民医院），伦理批号EC-YLY-2025-132-01，采用qRT-PCR（3例正常/4例OA）和Western blot（3例正常/6例OA）验证CARS表达。
研究结果：
Differentially expressed gene analysis：以P<0.05和FC=1.3为界，鉴定1648个差异表达基因，其中865个上调、783个下调；KEGG富集显示上调通路包括Rheumatoid arthritis、Viral myocarditis、Leishmaniasis、Lysosome function、Staphylococcus aureus infection，下调通路包括TNF signaling、Circadian rhythm、MAPK signaling、HIF-1 signaling、Fluid shear stress along with atherosclerosis；GO富集显示上调生物学过程包括leukocyte proliferation、leukocyte adhesion、neutrophils activation involved in immune responses、lymphocyte proliferation、mononuclear cell proliferation，下调包括rhythmic phenomena、fat cell differentiation、positive regulation of vascular development及lipid metabolism和vascular development调控。得出OA滑膜差异基因与炎症免疫及代谢/血管过程相关。
Differentially expressed ferroptosis-related genes：以P<0.05为阈值，鉴定6个差异FRGs：ACSL4、CARS、CS、LPCAT3、SAT1、SLC1A5。得出这些FRGs在OA滑膜差异表达。
WGCNA：对全部基因构建共表达网络，鉴定16个模块；Brown模块与OA最强正相关，r=0.63，p=3e?08，包含413个基因。得出Brown模块与OA相关。
Screening OA-related ferroptosis genes using machine learning：构建随机森林、SVM和XGBoost分类模型；训练集AUC分别为1、0.963、1，测试集AUC分别为0.850、0.950、0.75，SVM测试性能最佳；将差异FRGs、Brown模块基因和三种模型重要基因取交集，鉴定CARS。得出CARS为关键候选FRG。
CARS and immune cell infiltration characteristics reveal the heterogeneity of pro-inflammatory microenvironment in OA：CIBERSORT分析显示OA组与对照组免疫细胞浸润差异显著（FDR<0.05）；OA组M0 macrophages、γδ T cells、activated NK cells等促炎免疫细胞增加，naive B cells、memory B cells、Tregs等免疫调节细胞减少；M1 macrophages比例升高；CARS表达与Tfh正相关（r=0.41，p=0.019）；PCA显示PC1贡献率60%，OA组分散更高。得出OA滑膜呈“促炎优势-抑制不足”免疫特征，CARS-Tfh轴提供潜在方向。
ceRNA network analysis reveals the regulatory association of CARS in OA：CARS为核心节点，与LINC00689、hsa-miR-299-5p、hsa-miR-1184等非编码RNA及AP001878.4、TMEM191A等基因形成网络；CARS与hsa-miR-299-5p/hsa-miR-1184强关联；hsa-miR-299-5p抑制NF-κB和MAPK炎症级联，hsa-miR-1184参与滑膜细胞外基质重塑调控；lncRNA-miRNA-CARS轴构成多层转录后调控网络，可同步调节铁死亡和滑膜炎症反应；CARS与LINC00689、AP001878.4直接连接。得出CARS可能通过ceRNA机制协调铁死亡和免疫炎症过程。
Validation results of CARS tissue samples：qRT-PCR采用2
?ΔΔCt法计算相对表达，OA组CARS mRNA均值4.141显著高于对照组0.4009，均差3.740（95% CI: 2.053–5.427），P=0.0023；Western blot显示OA组CARS蛋白均值0.4987显著高于对照组0.1222，均差0.3766（95% CI: 0.05566–0.6974），P=0.0284；CARS约110 kDa，GAPDH约36 kDa。得出CARS在OA滑膜mRNA和蛋白水平升高，支持生物信息学预测。
讨论部分总结：本研究整合多个GEO数据集、差异分析、WGCNA和机器学习，将CARS识别为与OA滑膜病理相关的候选FRG；功能富集提示差异基因主要与炎症和免疫相关通路有关，包括Rheumatoid arthritis、TNF signaling和leukocyte proliferation，但这些通路是否由OA滑膜炎中铁死亡相关机制直接驱动仍需实验验证。三种机器学习模型中SVM在测试集表现最佳（AUC=0.950）。CARS在OA组织升高，参与cysteine and methionine metabolism pathways；作为氨酰-tRNA合成酶，CARS可能影响细胞内cysteine可用性，而cysteine是谷胱甘肽（glutathione, GSH）合成的关键底物；GSH是GPX4介导抗氧化防御的必需辅因子，cysteine代谢改变可能影响细胞对脂质过氧化和铁死亡的易感性，但该联系仍为假设。CARS与Tfh正相关提示CARS表达与OA滑膜免疫细胞组成可能存在关联，但方向性和因果性不清。ceRNA网络提示CARS可能受LINC00689、hsa-miR-299-5p等非编码RNA调控；hsa-miR-299-5p等miRNA参与NF-κB和MAPK通路的报道提示其功能相关性，但在OA滑膜炎中仍需实验确认。qRT-PCR和Western blot支持CARS在OA滑膜mRNA和蛋白水平升高，但样本量较小，应视为初步验证。研究优势为整合生物信息学、机器学习和实验验证；局限包括公共数据集和验证队列样本量较小、CARS与铁死亡及免疫浸润的关联主要为相关性、缺乏直接机制证据、机器学习模型可能过拟合、缺乏多中心验证。未来需更大独立队列和功能实验，尤其gain- and loss-of-function实验及体内验证模型，以明确CARS是否直接调控滑膜组织铁死亡和免疫反应。
研究结论翻译：本研究中，研究人员应用整合生物信息学分析和多种机器学习方法探索OA滑膜炎中的FRGs特征。通过分析公共基因表达数据集，CARS被鉴定为潜在与OA滑膜病理相关的候选铁死亡相关基因。进一步分析显示，CARS在OA滑膜组织中显著上调，并与Tfh浸润呈正相关，提示OA滑膜炎中铁死亡相关代谢改变与免疫微环境变化之间可能存在联系。此外，ceRNA网络分析表明CARS可能受多种非编码RNA调控，暗示复杂的转录后调控格局可能参与其表达变异。qRT-PCR和Western blot实验验证支持生物信息学观察，即CARS在OA滑膜组织中mRNA和蛋白水平升高。总体而言，这些发现提示CARS可能作为与OA滑膜炎中铁死亡和免疫相关过程相关的潜在候选生物标志物。然而，目前结果主要是相关性的，需要更大独立队列的进一步功能研究以阐明潜在生物学机制并评估其潜在临床相关性。
