整合结构分析揭示痘病毒核心内多聚体孔道复合物的分子架构

《Nature Communications》：A multimeric pore complex in the poxvirus core revealed by integrative structural analysis

长期以来已知痘病毒(poxvirus)可在其核心(core)内转录一百多种早期信使RNA(messenger RNA, mRNA)，然而这些转录本如何离开核心仍属未知。研究人员将冷冻电子断层扫描(cryo-electron tomography, cryo-ET)与基于深度学习的颗粒挑选(deep-learning-based particle picking)、亚断层图平均(subtomogram averaging, STA)、交联质谱(cross-linking mass spectrometry, XL-MS)以及AlphaFold3（AF3）建模相结合，解析了痘病毒核心内这一长期寻求的孔道(pore)的分子架构。该孔道由病毒蛋白E8、E6与L3的异源组装形成，共同构建出跨越核心壁(core wall)及表面暴露栅栏层(palisade layer)的空心六聚体管。在孔道通道内，研究人员观察到一种与病毒RNA解旋酶(viral RNA helicase) I8形态一致的杆状密度，其可能参与新合成病毒mRNA自核心的释放。研究人员进一步观察到，在转录条件下存在缺乏外环(outer ring)与基环(basal ring)的孔道状态。上述发现共同鉴定了双链DNA病毒表面层内一个候选mRNA释放孔(mRNA-release pore)的结构与动态特征，并提示该结构可能构成痘病毒转录机器(transcription machinery)的一部分。

**研究背景**

痘病毒(poxvirus)是在宿主细胞质内复制的双链DNA病毒，涵盖天花病毒(Variola virus)与引发Mpox（猴痘）国际关注的突发公共卫生事件的Mpox病毒。其成熟病毒粒子(mature virion, MV)呈砖形，包裹双凹核心(core)及侧体(lateral bodies)。病毒进入细胞后，核心被释放至细胞质，其内转录机器可立即启动一百余种早期信使RNA(messenger RNA, mRNA)的合成，转录本随后释放入细胞质供翻译。然而，这些mRNA如何跨越核心壁(core wall)离开核心，数十年来悬而未决。早期研究虽在核心表面栅栏层(palisade layer)中观察到由A10三聚体环绕的孔状结构并推测其为mRNA释放位点，但分辨率限制使其蛋白组成无法确证，构成理解痘病毒早期基因表达的关键空白。

**研究开展、主要结论与意义**

针对这一空白，研究人员以牛痘病毒(vaccinia virus, VACV)为对象，整合冷冻电子断层扫描(cryo-electron tomography, cryo-ET)、亚断层图平均(subtomogram averaging, STA)、交联质谱(cross-linking mass spectrometry, XL-MS)与AlphaFold3（AF3）建模，首次解析痘病毒核心内多聚体孔道复合物的分子架构（分辨率约8.2 ?）。研究确定孔道由E8、E6与L3组装成跨越核心壁与栅栏层的三层空心管道，并提示管腔中央杆状密度可能对应病毒RNA解旋酶(I8)，为“痘病毒核心mRNA释放孔”假说提供了首个结构性实证。该工作发表于《Nature Communications》，深化了对痘病毒早期基因表达结构基础的认识。

**主要技术方法**

研究人员将纯化的VACV Western Reserve株无膜核心与三磷酸核苷(NTP)转录缓冲液孵育5分钟后快速冷冻，采集89个倾斜序列(tilt series)行cryo-ET与STA；建立整合3D U-Net分割、GAPSTOP模板匹配与表面法向过滤的自动化颗粒挑选流程；采用二琥珀酰亚胺亚砜(DSSO)交联剂行XL-MS鉴定相互作用蛋白；利用AF3及AF3x对候选蛋白行单体至十二聚体预测并密度拟合建模；另以感染复数(MOI) 100感染HeLa细胞30分钟行原位cryo-ET验证。

**研究结果**

（一）VACV核心经cryo-ET分析。转录激活的核心侧体脱离、基因组解聚，部分核心壁破裂；栅栏层保持不变，顶部视角可见六个A10三聚体环绕的孔状结构。

（二）自动化孔道颗粒挑选的高通量流程。整合3D U-Net分割、GAPSTOP模板匹配与表面几何过滤建立自动化流程，以32个人工挑选孔道平均作为初始模板，从119个核心中获得2,678个颗粒用于精细STA。

（三）孔道复合物是由六个A10三聚体支撑的六聚体管。STA获得约8.1 ?分辨率重建，显示孔道为直径约15 nm、高约20 nm的六聚体管（含周围A10三聚体时直径约30 nm），含外环、内环、基环及中央杆状密度，C₆对称性经随机化检验确认源自数据本身。

（四）XL-MS鉴定孔道复合物组分。XL-MS在两个生物学重复中鉴定出233个蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interactions, PPIs)；E6与周围A10三聚体交联，L3同时与A10、E6及核心壁蛋白A3交联；结合AF3预测与密度全局搜索，确定E8六聚体占据外环、E6六聚体占据内环、L3占据基环，A3因拟合较差而归入核心壁。

（五）孔道复合物的拓扑与结构域组织。E8外环N端朝向组装中心、C端位于基部，相邻原聚体经保守极性网络连接；E6结构域1夹于E8单体对之间，结构域2以N-C端互作稳定环化；L3十二聚体中，内环衬于中央通道，外环与E6经疏水作用相接，内环相邻原聚体间形成三链β折叠（β-hairpin）。

（六）分类揭示转录条件下存在去盖孔道状态。de novo（从头）分类仅在转录条件下一致发现缺乏外环（E8）与基环（L3）的第3类结构，即“去盖孔道(uncapped pore)”；共检测到1,397个此类颗粒，约占该条件孔道总数的一半，且其在完整与破裂核心间无显著定位偏好。

（七）中央杆状密度位置可变。杆状密度（高约9 nm）与孔道轴强对齐，主要绕轴旋转而非倾斜，轴向位置呈连续变异性（标准差约1.3–1.5 nm），表明位置缩短源于位置异质性；AF3系统筛选显示病毒RNA解旋酶I8（以单体形式发挥功能）被一致定位于管腔中央，其预测形状、尺寸及与L3的交联（I8残基378与L3残基272，C_α-C_α距离约16 ?，在DSSO约35 ?跨度约束内）均与杆状密度相符，提示I8为合理候选。

（八）细胞内原位孔道架构与体外结构一致。以MOI 100感染HeLa细胞30分钟后行原位cryo-ET与STA，获得159个颗粒，约40 ?分辨率的重建再现了六个周围A10三聚体及外环、内环、基环与中央杆等关键架构特征，支持该结构在感染细胞内的生物学相关性。

**讨论与结论**

讨论部分将结构置于功能背景：孔道全部四种组分（E8、E6、L3与I8）均与痘病毒早期转录相关——E8为转录能力所需，E6参与成熟病毒组装且体外转录必需，L3缺陷病毒仅产生痕量早期mRNA，I8缺陷病毒无感染性。该孔道形成连续亲水通道，其负电表面与选择性mRNA转位孔相似，概念上可类比核孔复合体(nuclear pore complex, NPC)与冠状病毒感染诱导的膜孔。三层架构可能赋予各环不同功能：L3环作为mRNA进入中央通道的门户并穿透核心壁，E6层作为由六个A10三聚体固定的支架，E8层提供面向细胞质的mRNA出口；转录条件下观察到的E8/L3去盖现象可能反映孔道功能状态转变。杆状密度在两种条件下持续存在，其动力学特征与AF3预测的I8形状一致，结合I8的mRNA释放需求，研究人员提出I8为杆状密度候选的假说：mRNA输出可能由解旋酶主动驱动而非自由扩散，通道与杆间约2 nm间隙几何上兼容单链RNA通过。Calcraft等的同期独立研究解析了相同三组分（E8、E6、L3）的六聚体排列，与本研究相互印证，但其基于已有图谱的分类策略未观察到NTP添加后的去盖状态，本研究的de novo分类策略检测到更广泛的构象状态。综上，孔道复合物的架构、蛋白组成、电学性质与动态行为共同支持其参与（直接或间接）早期mRNA自核心释放的假说，但精确机制作用、杆状结构功能及感染早期E8/L3解离的调控等问题仍有待未来原位结构功能研究阐明。