中红外光热光学衍射层析成像实现视频级体素化学成像

《Nature Communications》：Video-rate volumetric chemical imaging via mid-infrared photothermal optical diffraction tomography

无标记振动显微镜通过内源性分子振动提供化学特异性信息，但在亚秒时间尺度上对细胞内动态过程进行定量体素成像仍具挑战。研究人员提出视频级中红外光热光学衍射层析成像（MIP-ODT），将高光热灵敏度与快速角度扫描相结合。该系统达到每秒19.2个体素（vps），较既往MIP层析实现快近400倍，信噪比（SNR）超过70且无需时间平均。研究人员在活细胞中追踪脂滴，从三维轨迹量化异常扩散，揭示二维测量中被掩盖的异质性胞内传输行为。快速中红外波数扫频进一步在1秒内跨越300 cm?1谱窗实现宽带多波数体素化学成像。结果表明，MIP-ODT可作为高速、无标记、单细胞体素化学成像平台，并用于动态胞内组织的定量研究。

研究背景与立项依据

在生命科学中，体素成像为亚细胞架构与动态过程提供三维通路。无标记振动显微直接利用内源性分子振动获取化学特异性，避免外源标记对原生状态的扰动；相干拉曼显微可实现快速二维成像，但体素化受限于点扫描与信噪比权衡，最快仅约每秒一体素，难以捕捉亚秒级胞内动态。中红外光热（MIP）显微利用中红外吸收引发局域折射率（RI）变化，再由可见光探针探测，突破中红外衍射极限；结合光学衍射层析（ODT）可反演三维RI分布。然而既往宽场MIP层析低于0.05 vps，瓶颈在于单角度信噪比不足与可见光角度切换慢。为此，研究人员在《Nature Communications》报道一种联合提升单帧光热灵敏度与角度扫描速度的MIP-ODT框架，建立视频级无标记体素化学成像新范式。

主要关键技术方法

研究人员搭建单物镜反射式ODT系统，采用两台同步调Q Nd:YAG激光器分别驱动可见光探针与中红外光参量振荡器（OPO）泵浦；以高速空间光调制器（SLM）实现422.4 Hz倾斜照明角度切换，11个照明角度交替采集MIR-ON与MIR-OFF离轴数字全息图；提出直接差分复场重建算法，从中反演MIP诱导RI变化的三维分布。样本为硅基底培养的COS-7细胞（来自JCRB细胞库），活细胞经油酸诱导脂滴，固定细胞用于多波数光谱成像。

研究结果

视频级MIP-ODT系统

通过评估不同照明角度数的重建保真度，固定采用11个角度。SLM周期2.3 ms，体积速率422.4/(2×11)=19.2 vps，有效体素采集时间52 ms。系统设单波数视频模式与宽带多波数光谱模式，中红外脉冲能量约3 μJ、脉宽10 ns，抑制热扩散模糊与热堆积。

空间分辨率和信噪比验证

对活COS-7细胞在2920 cm?1（CH?不对称伸缩）成像。MIR-OFF噪声RI波动4.2×10??，峰值信号3.0×10?3，SNR≈71.4。细胞内颗粒高斯拟合得横向分辨率约360 nm、轴向约1.15 μm，接近理论点扩散函数。

高速宽带多波数光谱体素成像

集成中红外快速扫频，1秒内覆盖约300 cm?1。固定细胞在2800–3100 cm?1区间成像：2920 cm?1突出脂类CH?，2950 cm?1含蛋白质CH?宽带贡献。核仁区域非负最小二乘（NNLS）拟合以牛血清白蛋白（BSA）、鸟苷、油酸为参考，显示蛋白与核酸主导；胞质脂滴以油酸与胆固醇拟合，不饱和酰链约56%、固醇类约44%，实现三维位点化学表型。

视频级脂滴三维追踪

油酸处理活细胞连续3.6 s、19.2 vps追踪。单脂滴三维轨迹位移各轴约200–300 nm；均方位移（MSD）幂律拟合异常指数α=0.32，呈显著亚扩散。另一脂滴出现阶跃重定位（0.28 μm），分轴α_X=0.68、α_Y=0.34、α_Z=0.14，揭示二维投影不可见的轴向约束。50个轨迹显示Dα跨10?3–10?2 μm2 s?α，α空间图谱表明核外区域运动受限更弱。

讨论与结论翻译

讨论指出，该工作并非简单高速ODT叠加MIR，而是解决弱MIP相位在快扫角下的稳定性难题。实用区间适用于单细胞至数十微米薄样，厚组织受水吸收与会聚散射限制。未来可通过可编程照明、角度复用、高NA与短波长探针将横向分辨率推至126 nm；换用AGS或BGSe晶体可拓展指纹区振动带。应用上可追踪脂滴生成、融合及生物分子凝聚体相分离的化学重组。

研究结论：研究人员建立视频级MIP-ODT，以高光热灵敏度与高速角度扫描打破速度—灵敏度权衡；实现19.2 vps体素化学成像与1秒级300 cm?1宽带光谱体素采集，无标记追踪活细胞脂滴三维异常扩散并解析亚细胞化学异质性，为单细胞动态胞内组织的高速定量化学成像提供平台。