ELKIN1依赖性Ca++闪烁信号依赖肌动蛋白-肌球蛋白收缩性：黑色素瘤细胞-基质界面机械转导新机制

《npj Biological Physics and Mechanics》：ELKIN1-dependent Ca++ flickers in melanoma cells depend on acto-myosin contractility

　　

黑色素瘤细胞迁移受ELKIN1表达的影响，该离子通道在机械刺激经基质施加于细胞-基质界面时支持机械诱发电（mechanically-evoked currents）。黑色素瘤细胞中敲除ELKIN1可影响细胞迁移、细胞侵袭及细胞对变化重力负荷的适应。本研究探讨在无外部施加力的情况下，ELKIN1是否介导细胞-基质界面的钙闪烁（calcium flickers）作为通道活性指标。研究发现，在WM266/4黑色素瘤细胞中可检测到钙闪烁，且这些闪烁在很大程度上依赖ELKIN1表达及肌动蛋白-肌球蛋白收缩性（acto-myosin contractility）。在缺失ELKIN1的细胞中检测到残余钙闪烁活性，该活性部分依赖TRPV4（瞬时受体电位香草酸亚型4）。然而，该活性未被细胞收缩性抑制进一步阻断。上述数据提示，ELKIN1依赖性信号可由细胞收缩性产生的机械线索所启动。

**研究背景与科学问题**

实体瘤的发展伴随局部肿瘤微环境的改变，包括细胞周围基质硬度增加，可影响转移级联并促进癌细胞侵袭的初始步骤。既往研究集中于整合素（integrin）家族蛋白在基质力学变化驱动的癌细胞侵袭增强中的作用，揭示力传感蛋白可将肿瘤细胞微环境物理特性转导为生化线索。近期研究提示整合素并非细胞内唯一调控癌细胞侵袭性的力传感分子。机械激活（mechanically activated, MA）离子通道是一类在广泛生理系统中调控细胞功能的力传感分子，不仅参与细胞顶端表面的力感知，也可在细胞与基质连接处介导机械转导。MA离子通道激活研究多集中于其转导外部施加力的能力，但细胞自身可通过肌动蛋白-肌球蛋白收缩性对周围基质施力：肌球蛋白-II（myosin-II）马达蛋白与极性丝状肌动蛋白结构协同，在细胞-基质连接处产生收缩力。在Piezo通道发现之前，利用光镊对胞内包被鬼笔环肽的微珠施力的研究显示，在肌动蛋白应力纤维上产生张力可激活MA离子通道；后续研究揭示PIEZO1可在细胞-基质界面由肌动蛋白-肌球蛋白依赖性细胞生成力激活。这些细胞生成力被认为使细胞得以探测周围力学环境，调控细胞对变化力学条件的适应。然而，既往仅在神经干细胞、成纤维细胞和角质形成细胞中报道了收缩性依赖的PIEZO1激活，其他离子通道是否可被类似激活尚不清楚；且有报道基于少量细胞系样本认为转化或癌变细胞中检测不到离散的MA离子通道介导的Ca⁺⁺内流。

ELKIN1介导机械诱发电流的作用最初在WM266/4黑色素瘤细胞中通过膜片钳电生理（patch-clamp electrophysiology）识别。采用CRISPR/Cas9基因编辑删除ELKIN1（ELKIN1-KO）后，机械诱发电流消失，细胞迁移与侵袭特性改变：WM266/4 ELKIN1-KO细胞在二维（2D）基质上迁移速度下降，从嵌入三维（3D）胶原凝胶的器官型球状体（organotypic spheroids）中解离增加。这些过程不依赖外部施加的机械输入，而由细胞-基质及细胞-细胞相互作用驱动。由于膜片钳电生理不适用于分析细胞生成力引起的通道激活，研究人员采用荧光钙染料与全内反射荧光（Total Internal Reflection Fluorescence, TIRF）显微镜可视化通道活性，检测WM266/4黑色素瘤细胞中是否存在瞬态Ca⁺⁺内流，以及这些事件是否依赖肌动蛋白-肌球蛋白收缩性和/或ELKIN1。

**关键技术方法**

研究使用亲本WM266/4转移性黑色素瘤细胞系（RRID:CVCL_2765）来源的野生型（WT）及既往已构建并验证的ELKIN1-KO细胞系，传代4–20代内用于实验。主要技术包括：细胞负载荧光钙染料Calbryte 520 AM后，于37 °C下用Zeiss Elyra 7显微镜TIRF模式以10 ms曝光采集1000帧图像序列；在Matlab平台开发内部图像分析程序，经时间移动平均滤波（50帧窗口）去除时不变成分、二维高斯空间平滑（sigma=7像素）及阈值化检测钙闪烁事件，并以细胞-基质界面面积归一化事件频率；采用TRPV4激动剂GSK1016790A与拮抗剂GSK2193874、肌球蛋白抑制剂para-amino-Blebbistatin（paBlebbistatin）、微管解聚剂nocodazole进行药理学干预；以pmCherry-Paxillin瞬时转染标记黏着斑（focal adhesion, FA）；以探针法qPCR检测ELKIN1 mRNA水平（以HPRT为内参）；以Live-or-Dye 640/662试剂盒评估细胞活力；并在Sylgard 527/184铸造的微柱阵列上估算细胞生成力。统计分析在GraphPad Prism 9中完成，非参数数据采用Kruskal-Wallis检验联合未校正Dunn's检验或Mann-Whitney检验。

**研究结果**

*WM266/4细胞细胞-基质界面可检测到钙闪烁*：WT WM266/4细胞负载Calbryte 520 AM后经TIRF成像，原始数据定性评估显示染料强度出现局部、瞬态升高（即Ca⁺⁺闪烁）。经内部程序分析生成每个细胞的事件图谱。55/55个分析细胞均检测到事件，但不同细胞间闪烁数量存在差异；事件分布于整个细胞-基质界面，距细胞边界（即细胞黏附区域边缘）中位距离为6.46 μm。与已知FA标志物Paxillin分布比较，闪烁与FA结构不重叠。

*ELKIN1与TRPV4在WM266/4细胞中可能具有部分重叠的信号通路*：WT与ELKIN1-KO细胞的细胞-基质界面表面积存在显著差异，故以面积归一化闪烁事件数。与WT相比，ELKIN1-KO细胞在10 s窗口内单位面积每秒可视闪烁数显著减少。鉴于PIEZO1在WM266/4细胞中无活性，残余闪烁必依赖另一通道；多模态离子通道TRPV4既往被证明在细胞-基质界面介导外部施力诱发的机械电流，故被视为候选。应用TRPV4强效特异性激动剂GSK1016790A可使WT细胞内Ca⁺⁺浓度升高（宽场落射荧光显微镜观察），证实存在活性TRPV4；应用特异性TRPV4抑制剂GSK219后，WT细胞闪烁频率显著降低，提示TRPV4参与细胞-基质界面局部Ca⁺⁺内流。对ELKIN1-KO细胞施加GSK219后，平均闪烁频率进一步显著降低，且无闪烁活性细胞比例显著增加（12/46 vs 3/40，p=0.044，Fisher精确检验），提示ELKIN1与TRPV4并非专属于同一功能复合体。事件距细胞边界分布的改变进一步支持该观察：ELKIN1-KO细胞闪烁较WT更靠近细胞边界；GSK219使WT闪烁分布进一步远离边界，而使ELKIN1-KO细胞剩余闪烁更靠近边界；将ELKIN1-KO与WT+GSK219细胞全部闪烁合并后的"叠加"数据集分布与WT相当（p(ns)=0.8532）。直方图高斯拟合显示ELKIN1-KO与WT+GSK219细胞呈现不同但部分重叠的闪烁分布。尽管ELKIN1-KO细胞接触面积减小与长宽比改变会影响数据，但频率分布显示其近边界闪烁亦减少，故形态差异不能解释全部分布变化。上述数据提示TRPV4依赖性Ca⁺⁺闪烁发生区域与ELKIN1依赖性闪烁仅部分重叠。

*过表达ELKIN1-isoform 1可恢复ELKIN1-KO细胞的钙闪烁*：为排除敲除细胞系衍生所致的克隆效应，在ELKIN1-KO细胞中瞬时过表达ELKIN1-isoform 1并重复闪烁分析。过表达导致ELKIN1 mRNA水平高于WT细胞，并使单位面积闪烁频率较ELKIN1-KO克隆及WT细胞均显著增加。该实验证实ELKIN1表达与细胞-基质界面局部Ca⁺⁺内流相关。

*ELKIN1闪烁依赖细胞生成力*：为探究观察到的闪烁是否依赖细胞内产生的力，采用药理学手段破坏参与内部力生成的细胞结构。paBlebbistatin与处于肌动蛋白脱离状态的肌球蛋白结合，阻止肌动蛋白-肌球蛋白交联并抑制收缩性；选用该衍生物系因其光毒性和荧光较Blebbistatin降低。WT细胞经paB处理较对照闪烁显著减少；而ELKIN1-KO细胞经paB处理较对照无活性降低。paB处理未降低细胞活力，但减少了施加于下层基质的细胞生成力。这些数据表明WT细胞局部Ca⁺⁺闪烁在很大程度上依赖肌动蛋白-肌球蛋白收缩性，ELKIN1依赖性闪烁需要肌动蛋白-肌球蛋白依赖性细胞收缩性，同时也提示存在不依赖类似过程的额外Ca⁺⁺闪烁活性。为检验TRPV4是否不受肌动蛋白-肌球蛋白依赖性收缩性激活，对WT细胞联合应用GSK219与paB，虽观察到事件数下降趋势但无统计学显著性。

由于微管延伸也可能产生突出力，研究以nocodazole（结合微管蛋白、破坏微管聚合与动态）处理WT与ELKIN1-KO细胞。处理未降低细胞活力，两类细胞闪烁活性均未减少，提示微管延伸可能不参与内部细胞生成力对ELKIN1和TRPV4的激活；WT细胞微管破坏后观察到事件数增加趋势（无统计学显著性），鉴于微管基本产生与肌动蛋白-肌球蛋白相反的力，该观察可能反映肌动蛋白-肌球蛋白依赖性收缩性增强及ELKIN1介导信号随之增加的趋势。

**讨论与结论**

哺乳动物MA离子通道活性在广泛生理组织中调控出乎意料的多样细胞功能，可响应膜张力与曲率变化、细胞牵张、流体剪切及拉伸力等不同机械输入而被激活。除外部施加力外，细胞收缩性可在细胞与基质连接处产力。PIEZO1由肌动蛋白-肌球蛋白依赖性细胞生成力激活最初在神经干细胞与成纤维细胞中发现，后扩展至角质形成细胞与巨噬细胞的PIEZO1依赖性Ca⁺⁺闪烁。本研究显示细胞生成力在WM266/4黑色素瘤细胞细胞-基质界面引起Ca⁺⁺闪烁，表明缺乏PIEZO1的细胞也可在细胞-基质界面离散区域内表现局部、瞬态Ca⁺⁺内流；敲除ELKIN1后闪烁数量显著减少，过表达ELKIN1可恢复闪烁；paBlebbistatin抑制肌动蛋白-肌球蛋白收缩性显著减少WT细胞闪烁，表明收缩性依赖性离子通道活性不限于PIEZO1，在表达ELKIN1时亦可观察到。估算WM266/4细胞在细胞-基质接触点施加的细胞生成力平均为54 pN，对应单个微柱偏转127 nm，与既往电生理实验中超过100 nm的微柱偏转引起ELKIN1介导电流稳健激活的报道一致；但需谨慎，可变形微柱阵列上测得的细胞生成力不代表TIRF分析所用硬基质上的细胞生成力，且目前无法确定因细胞收缩性或微柱偏转传播至任何力传感离子通道的力。尽管如此，这些数据提示ELKIN1依赖性电流既可被外部施加力诱发，也可被引起相似量级基质位移的内部生成力诱发。

在人包皮成纤维细胞中，PIEZO1依赖性Ca⁺⁺活性见于高牵引力区域，并随后利用与FA蛋白paxillin融合的遗传编码钙指示剂直接定位于FA结构；但在其他细胞类型中该关联未被复制。本研究发现ELKIN1依赖性Ca⁺⁺闪烁与paxillin定义的FA结构不共定位，提示既往报道的ELKIN1对该细胞类型FA域的影响（FA结构较WT增大）并非局部Ca⁺⁺内流的直接结果，而是破坏ELKIN1功能的下游影响。这些发现也凸显PIEZO1与ELKIN1依赖性Ca⁺⁺活性在细胞-基质界面的另一关键差异：PIEZO1活性可稳定FA结构，而ELKIN1依赖性闪烁不定位至FA，且ELKIN1缺失增大FA。

在ELKIN1-KO细胞中观察到残余Ca⁺⁺闪烁，引出了这些细胞中其他离子通道是否也由肌动蛋白-肌球蛋白收缩性激活的问题。既往研究显示多模态离子通道TRPV4在力施加于细胞-基质连接处时介导机械诱发电流，包括在缺乏PIEZO1的细胞中。本研究以特异性强效拮抗剂阻断TRPV4可减少WT与ELKIN1-KO细胞的Ca⁺⁺闪烁，提示ELKIN1-KO细胞的残余活性主要由TRPV4介导。然而，以paB阻断肌球蛋白活性未使ELKIN1-KO细胞活性进一步降低；WT细胞联合应用TRPV4抑制剂与paBlebbistatin仅呈无统计学显著性的活性下降趋势，提示部分TRPV4依赖性Ca⁺⁺活性不依赖肌动蛋白-肌球蛋白生成的胞内力，也凸显了在完整细胞中界定TRPV4精确门控机制的持续挑战。

这些发现进一步充实了MA离子通道作为具有独特激活谱的柔性力传感器的图景。PIEZO1介导电流可响应局部膜牵张、细胞压痕、基质位移或超声应用等外部施加力及肌动蛋白-肌球蛋白收缩性产生的内部生成力，而其他MA离子通道的激活并不如此广泛：固有机械敏感的TREK-1由膜牵张与细胞压痕激活但不响应基质位移，TMEM63家族成员由局部膜牵张而非细胞压痕激活。相反，ELKIN1与TRPV4介导电流最稳健地由在细胞-基质接触点产生外部机械刺激的基质位移诱发，其动力学足够快，提示通道直接机械激活。本研究数据表明细胞生成力引起ELKIN1依赖性局部Ca⁺⁺闪烁，提示PIEZO1并非唯一可在细胞-基质界面介导依赖内部细胞生成力的快速、瞬态、局部Ca⁺⁺信号的离子通道。

关于MA离子通道如何在细胞-基质界面被激活，既往对PIEZO1及细菌MA离子通道MscL的研究均提出肌动蛋白-肌球蛋白收缩性产生的力在细胞-基质接触点引起局部膜张力变化，进而激活通道。该解释可能适用于PIEZO1与MscL（二者均为可由force-from-lipids机制激活的固有机械敏感通道），但忽略了可能的力共享机制，即门控力经脂质双分子层与蛋白性系连元件共同汇聚于通道。值得注意的是，破坏肌动蛋白结构既往被证明可减少基质位移对PIEZO1的激活，提示该膜区室中PIEZO1激活可能涉及此类力共享机制；且基质位移预测的膜张力变化低于PIEZO1激活阈值。此外，鉴于纯化ELKIN1重构于脂质双分子层时不被周围脂质操纵产生的力激活，膜张力变化不太可能解释ELKIN1依赖性Ca⁺⁺闪烁的激活。这些数据提示两种可能解释：其一，膜张力并非细胞生成力激活MA离子通道的唯一相关门控刺激；其二，MA离子通道响应肌动蛋白-肌球蛋白依赖性细胞生成力的激活对不同离子通道遵循独立通路。不同MA离子通道激活谱的变异性与第二种解释一致：细胞生成力传播并聚焦于细胞-基质接触点，但各MA离子通道随后可依其特定激活机制由局部膜张力改变、蛋白性系连产生的拉伸力或二者组合激活。至少本研究数据提示，仅膜张力变化不太可能解释肌动蛋白-肌球蛋白依赖性细胞生成力对全部离子通道的激活。

在本文研究的WM266/4黑色素瘤细胞中，TRPV4支持细胞-基质界面的Ca⁺⁺闪烁。由于TRPV4的多模态性，厘清其多样作用与激活模式颇具挑战；但因其在多种机械敏感细胞与组织中的功能作用，TRPV4长期被怀疑为MA通道。TRPV4不被膜牵张或压痕激活曾令人质疑其能否被机械输入直接门控；然而当以基质位移直接对细胞施加机械刺激时，可测得TRPV4依赖性机械诱发电流，即使在缺乏PIEZO1时亦然。本研究数据提示，在缺乏ELKIN1与PIEZO1活性的细胞中，TRPV4可介导细胞-基质界面快速、瞬态、局部的Ca⁺⁺闪烁；但多模态TRPV4是否介导依赖肌动蛋白-肌球蛋白收缩性的Ca⁺⁺闪烁尚不明确。本研究虽在PIEZO1无活性的细胞中进行，近期发现凸显TRPV4在调控硬度趋向性（durotaxis，即沿硬度梯度迁移）中的作用，作者据此提出PIEZO1作为主要机械传感器、TRPV4作为PIEZO1下游机械信号放大器的模型。本研究发现TRPV4依赖性Ca⁺⁺闪烁分布与ELKIN1依赖性信号不同但重叠，且在ELKIN1依赖性细胞中阻断TRPV4可进一步减少Ca⁺⁺闪烁；因此，尽管TRPV4可作为机械放大器，其在这些细胞中很可能并非仅放大ELKIN1依赖性机械转导。本实验在37 °C进行，而TRPV4可被中等温度激活，故在此条件下TRPV4依赖性钙闪烁活性至少部分可能代表通道的热激活。

综上，这些观察支持评估每种MA离子通道激活谱并在细胞类型、力学环境及其他MA离子通道存在与否的背景下考量其功能的重要性；这些变量均可改变各分子对细胞机械转导的贡献，而此贡献无法仅由表达水平推断。本研究拓展了对细胞-基质界面离子通道信号的理解：ELKIN1可介导响应肌动蛋白-肌球蛋白依赖性细胞生成力的Ca⁺⁺闪烁，一如既往对PIEZO1的证明。这些发现提示，源自细胞生成力或外部施加输入的机械刺激均可激活细胞-基质界面内的离子通道；此外，既往报道的ELKIN1缺失对细胞迁移、细胞从球状体解离及对重力负荷变化适应的影响，可能依赖由细胞生成力触发的力感知。ELKIN1（TMEM87a）并非仅定位于质膜；ELKIN1 isoform1亦定位于高尔基体，在那里作为电压依赖性通道发挥作用。此外，近期发表的研究显示耗竭ELKIN1可抑制小鼠多种类型肿瘤的进展，包括黑色素瘤，但这些发现与ELKIN1在高尔基体中的活性相关，具体为对铁死亡（ferroptosis）的调控。综上，这些数据提示ELKIN1可能是影响癌症多方面（质膜与胞内区室）的重要治疗靶点。