金龟子绿僵菌CQMa421与乙基多杀菌素协同互作增效防控西花蓟马（Frankliniella occidentalis）的机制与田间验证

《Virulence》：Combining Metarhizium anisopliae with spinetoram synergistically suppresses Frankliniella occidentalis via reciprocal enhancement

　　

杀虫剂与昆虫病原真菌（entomopathogenic fungi）的组合兼具高效性与环境相容性，已成为可持续害虫治理的重要策略，其高效组合方式及内在机制亦成为研究热点。金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）CQMa421与相容的乙基多杀菌素（spinetoram）复配对西花蓟马（Frankliniella occidentalis）表现出协同杀虫活性，可提高害虫对乙基多杀菌素的敏感性，抑制第二代若虫、蛹和成虫种群，并降低总体化蛹率。机制上，与单用乙基多杀菌素相比，复配处理上调抗性靶标nAChRα6并扰乱抗性相关解毒酶（GST、CarE、POD和CYP450）活性；与单用CQMa421相比，则下调免疫基因（GNBP1/2、Sp?tzle1/2、MyD88 1、Defensin和PPO）。相应地，CQMa421在蓟马体壁上的孢子萌发中时（GT₅₀）与附着胞形成中时（AT₅₀）显著缩短。田间试验显示，复配组合（1 × 10⁷ 个孢子/mL CQMa421 + 10 mg/L乙基多杀菌素）较20 mg/L乙基多杀菌素（分别为74.33%和43.33%）兼具更优的速效性与持效性（3 d为90.67%；14 d为86.33%）。与此一致，在连续防控试验中（复配处理施药6次，乙基多杀菌素施药9次），复配处理在侵染高峰期内维持了显著更低的蓟马种群密度。该研究表明，CQMa421与乙基多杀菌素复配可扰乱解毒酶活性、增强西花蓟马对药剂的敏感性，并促进CQMa421在体表的早期定殖，通过互作增强（reciprocal enhancement）实现协同防效。该协同作用已在田间条件下得到验证。上述发现为高效、安全的田间真菌—化学联合防控提供了理论与实践依据。

研究背景方面，西花蓟马（Frankliniella occidentalis）为多食性害虫，原产北美，个体小、发育快、繁殖力强且具隐蔽习性，通过取食、产卵为害并传播多种重要植物病毒（virus），化学杀虫剂仍是其主要防治手段，但广谱药剂的高强度使用已导致其对乙基多杀菌素（spinetoram，1487.7倍）、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐（emamectin benzoate，356倍）和吡虫啉（imidacloprid，127.8倍）等产生高水平抗性，目前该虫已对32种杀虫剂有效成分产生抗性，加之药剂非靶标效应与食品安全风险，亟需可持续的防控方案。昆虫病原真菌（entomopathogenic fungi）宿主范围广、具流行潜力且在土壤中可持久存活，但田间防效高度依赖温湿度等环境条件，且作用相对缓慢，受害虫在感病死亡前仍可取食造成为害。因此，加速真菌致病过程或提高寄主对真菌感染的敏感性成为重要方向。真菌与化学杀虫剂复配可借助二者作用方式的互补与对靶标寄主生物效应的相互增强实现协同，但其生理与分子机制尚待阐明。研究人员所在实验室分离并表征了广谱昆虫病原真菌金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）CQMa421，该菌已商品化登记用于防治10余种作物害虫（PD20171744），与噻虫嗪（thiamethoxam）等药剂复配在褐飞虱（Nilaparvata lugens）、棉蚜及草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）上已显示增效作用。前期研究表明CQMa421对西花蓟马种群具较高防效，故研究人员先筛选其与多种常规杀虫剂的生物相容性，确定相容性高的乙基多杀菌素为候选药剂，并系统评估复配组合对该虫的协同活性，探讨宿主防御、解毒与代谢途径被协同扰乱在增效中的作用，并在田间验证防效，以期为真菌与化学农药联合应用提供理论依据。

在技术方法上，研究以CQMa421孢子悬液与12种常规杀虫剂进行相容性（compatibility）测定，观察孢子萌发率与菌落生长；以西花蓟马雌成虫为对象，采用三层丙烯酸板生物测定装置结合Burkard喷雾塔定量施药，以独立作用（Independent Action, IA）模型和χ²检验判定相加、协同或拮抗作用，并计算LC₅₀及增效倍数；通过生殖与发育试验统计第二代若虫、蛹、成虫数量及化蛹率、羽化率；采用商业试剂盒测定羧酸酯酶（CarE）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）、过氧化物酶（POD）和细胞色素P450（CYP450）活性，并以实时荧光定量PCR（qPCR）及2^?ΔΔCT法检测nAChRα6与免疫相关基因表达；利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的CQMa421菌株于荧光显微镜下观察虫体表面孢子萌发与附着胞形成；并在重庆璧山茄子田开展田间小区试验与全生育期示范试验，种群调查参照Li等的方法。供试西花蓟马种群来自山东省农业科学院植物保护研究所，供试菜豆（Phaseolus vulgaris L.）采自重庆大学实验农场。

研究结果如下。在“筛选与CQMa421相容的化学农药”部分，12种杀虫剂中11种显著抑制CQMa421孢子萌发（F_12,26 = 26.65，p < 0.001），而6%乙基多杀菌素处理16 h时孢子萌发率达97.50% ± 0.50%，与对照（97.67% ± 0.58%）无显著差异，且含药平板上菌落直径在培养2–4 d后显著大于对照，表明乙基多杀菌素促进CQMa421生长。在“CQMa421与乙基多杀菌素对西花蓟马的协同增效作用”部分，1 × 10⁶与1 × 10⁷ 个孢子/mL CQMa421与乙基多杀菌素复配总体表现协同效应，以1 × 10⁷ 个孢子/mL组合增效更高；处理3 d后1 × 10⁷ 个孢子/mL CQMa421 + 0.3 mg/L乙基多杀菌素死亡率达97%（χ² = 8.48），显著高于CQMa421单剂的21%与乙基多杀菌素单剂的65%；复配使乙基多杀菌素对西花蓟马的LC₅₀由0.1626 mg/L（95% CI：0.0984–0.4203 mg/L）降至0.0358 mg/L（95% CI：0.0157–0.0585 mg/L），降低4.54倍，1 × 10⁶ 个孢子/mL组合的LC₅₀为0.0566 mg/L（95% CI：0.0401–0.0766 mg/L），相对单剂（0.2152 mg/L，95% CI：0.1661–0.3085 mg/L）降低3.80倍，说明CQMa421显著提高西花蓟马对乙基多杀菌素的敏感性并降低所需剂量。在“CQMa421与乙基多杀菌素复配对西花蓟马生殖的协同抑制”部分，与对照相比，各处理均显著降低单雌第二代若虫、蛹和成虫累积数量，抑制产卵与第二代种群；与乙基多杀菌素组和CQMa421组相比，复配处理单雌第二代若虫累积数分别降低41.13%和35.87%，蛹数分别降低48.02%和37.50%，成虫数分别降低55.33%和64.42%；两种单剂均抑制羽化率而不影响化蛹率，复配则同时显著抑制化蛹率与羽化率，较乙基多杀菌素组分别降低7.37%和10.02%，较CQMa421组分别降低7.06%和10.10%；χ²检验表明复配协同抑制第二代若虫、蛹、成虫数量及化蛹率，对羽化率抑制为相加效应。在“乙基多杀菌素与CQMa421对西花蓟马神经靶标基因、免疫反应及代谢酶的影响”部分，乙基多杀菌素使nAChRα6表达较对照上调2.41 ± 0.47倍，复配进一步上调至3.73 ± 0.22倍，提示靶标基因上调与复配杀虫效力增强相关；GST、CarE、POD和CYP450活性在24–72 h呈先升后降、48 h达峰的时间依赖性模式，复配组GST与POD活性在24–60 h显著高于单剂组而72 h显著降低，CarE与CYP450活性在24–48 h显著高于单剂组而60–72 h显著降低，表明复配诱导更早更强的代谢抗性相关酶响应、短期解毒能力增强但随后迅速下降；与CQMa421组相比，复配组模式识别受体GNBP1/2、Toll通路关键分子Sp?tzle1/2、接头蛋白MyD88 1、酚氧化酶原基因PPO及抗菌肽基因defensin表达显著下调，说明复配显著抑制病原识别、Toll样受体信号传导、抗菌肽合成与黑化反应等宿主免疫应答，可能为真菌侵入与定殖创造有利条件。在“乙基多杀菌素促进CQMa421在蓟马体表的萌发与附着胞形成”部分，复配显著加速CQMa421在虫体表面的早期侵染过程，孢子萌发更早且萌发率显著提高，GT₅₀为12.72 ± 0.33 h，缩短24.01%，附着胞形成率显著升高，AT₅₀显著缩短至21.42 ± 0.87 h，降低17.90%。在“CQMa421与乙基多杀菌素复配田间防效试验”部分，复配处理施药后3 d防效为90.67% ± 3.05%，显著高于CQMa421（52.67% ± 2.51%）、10.0 mg/L乙基多杀菌素（57.33% ± 4.75%）和20.0 mg/L乙基多杀菌素（74.33% ± 4.04%）（单因素方差分析，Tukey检验，p < 0.001，n = 3）；施药后14 d复配处理仍维持86.33% ± 4.75%的防效，显著高于20.0 mg/L乙基多杀菌素（43.33% ± 4.72%）和CQMa421（65.67% ± 2.88%），表明复配兼具速效性与持效性，可在提高防效的同时减少农药用量。在“复配处理对茄子全生育期西花蓟马的控制作用”部分，2024年4—9月在重庆璧山茄子全生育期开展试验，针对6—8月发生高峰分别施用7次乙基多杀菌素（20 mg/L）与4次复配处理，高峰期复配处理区种群密度稳定维持在每花2.3–6.3头，而20 mg/L乙基多杀菌素区为每花6.4–14头，同期显著高于复配区，表明该联合防控策略具有较大推广应用潜力。

讨论部分指出，西花蓟马威胁全球农业并传播植物病毒，广谱杀虫剂尤其是乙基多杀菌素的过度使用加剧抗性并降低防效，真菌与化学杀虫剂复配可提升防效并实现可持续治理；CQMa421已在我国登记，田间应用持效性优异，但高度依赖环境条件，本研究以减半剂量乙基多杀菌素与之复配即获得协同杀虫与抑制第二代种群的效应，显示其在有害生物综合治理（integrated pest management, IPM）中的应用潜力，同时提示同一有效成分因助剂种类与浓度及生产工艺差异可对孢子萌发产生不同影响（如不同厂家5%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐），实践中须先行测定相容性。化学杀虫剂可通过生理干扰、免疫抑制或行为改变与真菌协同，本研究证明CQMa421与乙基多杀菌素通过互作增强产生协同毒性，复配使乙基多杀菌素LC₅₀降低3.80与4.54倍；乙基多杀菌素为烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptor, nAChR）激动剂，以nAChRα6为核心功能靶标，该基因功能缺失突变或敲除可赋予对多杀菌素类高水平抗性，故复配下nAChRα6上调可能扩大对药剂敏感的功能靶标库而增强神经毒效，但该调控并非协同的唯一介导因素，复配还扰乱关键解毒酶活性并全面抑制从免疫识别（GNBP）到Toll通路信号转导及效应分子的免疫级联，从而促进真菌定殖。解毒酶先升后降的模式与斜纹夜蛾（Spodoptera litura）感染Metarhizium rileyi及白背飞虱（Sogatella furcifera）暴露于亚致死剂量噻虫嗪的报道一致，提示解毒酶代偿性上调是单一胁迫的常见代谢响应，其中POD在不同真菌—农药组合中升降模式较为一致，氧化应激响应可能相对保守，而GST与CarE响应变异较大（如飞蝗经金龟子绿僵菌与氯虫苯甲酰胺处理后二者初期受抑制），差异可能与解毒酶底物特异性及其对病原种类、药剂作用方式和寄主生理状态的敏感性有关。当前真菌—杀虫剂协同评估多关注当代种群而忽视幸存者子代，导致评价不完整；已有研究表明Isaria javanica感染显著降低白背飞虱幸存者化蛹率与总产卵量，乙基多杀菌素亦可降低多种昆虫产卵率，本研究系统分析了对幸存者生殖及第二代种群动态的影响，复配协同抑制第二代若虫、蛹、成虫数量与羽化率并降低化蛹率，成虫累积数较单剂下降逾50%，田间试验亦证实复配在乙基多杀菌素减量50%、施药次数减少33%的情况下优于其推荐剂量单用。作者也指出田间试验仅为重庆单点单生长季，防效应在特定环境与农艺条件下解读，真菌防效与乙基多杀菌素持效均受环境因素与施药方式影响，协同效应可能因地区、季节与种植制度而异，尚需多点多年田间试验验证其稳健性与广泛适用性；尽管如此，室内与田间一致的协同效应为该防控策略提供了初步证据。

结论部分译文为：本研究表明，金龟子绿僵菌CQMa421与减量50%的乙基多杀菌素复配对西花蓟马具有协同作用，可增强该害虫对乙基多杀菌素的敏感性并抑制其第二代种群。复配处理上调抗性靶标nAChRα6，同时扰乱代谢抗性相关酶（GST、CarE、POD和CYP450），表明西花蓟马代谢防御失调；此外，复配抑制免疫基因（GNBP1/2、Sp?tzle1/2、MyD88 1、Defensin、PPO），从而削弱宿主防御并促进真菌早期侵染。田间试验中，复配处理在降低施药频率与剂量的情况下，仍较化学农药更高效、持效更久。上述发现阐明了互作增强的协同机制，为绿色害虫防控与化学农药减量提供了依据。