《Animal Cells and Systems》：Comparative profiling of selected pattern recognition receptor (PRR) pathways reveals functional heterogeneity of monocytic models in the monocyte activation test
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单核细胞活化试验（monocyte activation test，MAT，通过检测人单核细胞细胞因子释放来定量热原的体外方法）基于人类单核细胞的细胞因子反应检测热原污染，并作为兔热原试验的替代方法。外周血单个核细胞（peripheral blood mono
单核细胞活化试验（monocyte activation test，MAT，通过检测人单核细胞细胞因子释放来定量热原的体外方法）基于人类单核细胞的细胞因子反应检测热原污染，并作为兔热原试验的替代方法。外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC，人外周血中包含单核细胞、淋巴细胞等的混合细胞群体）是MAT的参考细胞来源，然而供体差异和供应限制导致了THP-1、HL-60和U937细胞系等替代细胞系的频繁使用。因此，这些细胞系能否在超出内毒素的受体通路上复制PBMC的行为，目前尚属未知。在本研究中，研究人员比较了PBMC与细胞系对10种通过Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs，先天免疫系统中识别病原体保守分子结构的一类关键受体）和NOD2（nucleotide-binding oligomerization domain 2，胞质内识别肽聚糖的NOD样受体家族成员）发挥作用的热原刺激的IL-6反应。所有四种系统均平行检测，且每种刺激均在全剂量范围内进行测试。使用实时定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）在相同细胞中测量了相应受体的基础转录水平，并与公开可获得的表达数据进行了比较。针对每种刺激报告了检测限、精密度估计值和内毒素等效效价。PBMC对检测组合中的所有刺激均产生反应，并在大多数通路上产生最高的最大IL-6；而细胞系仅在较高的配体浓度下产生反应，且反应范围压缩于较窄的剂量–反应区间内。这些结果表明，原代与永生化单核细胞系统之间的关系取决于所识别的受体，而非固定幅度的灵敏度降低。对抗内毒素的表现并不能预测对抗非内毒素热原的表现，而后者正是MAT用于检测的主要污染物。
热原性污染可引发机体发热反应，在严重剂量下导致循环休克，因此注射药物、生物制剂及医疗器械的热原控制至关重要。传统的兔热原试验依赖动物整体发热反应，对多种非内毒素热原（non-endotoxin pyrogens，NEPs，除内毒素外可在人体内触发发热反应的细菌、真菌及病毒等污染物）敏感性不足，且存在动物伦理问题；鲎变形细胞溶解物（Limulus amebocyte lysate，LAL，基于鲎血细胞凝固级联反应的内毒素检测试验）虽对内毒素高度敏感，但无法检测革兰氏阳性菌、真菌和病毒来源的污染物。单核细胞活化试验（monocyte activation test，MAT，基于人单核细胞受刺激后释放细胞因子来报告热原负荷的体外方法）通过读取IL-6等细胞因子浓度替代动物发热，已被欧洲药典收载为通用章节2.6.30，成为最具前景的替代方案之一。PBMC因携带体内介导发热反应的单核细胞群而成为MAT的参考细胞来源，但供体差异、批次差异及材料供应限制促使THP-1、HL-60和U937等永生化单核细胞系被频繁用于替代。然而，既往直接比较原代细胞与永生化细胞系的研究多集中于内毒素或少数配体，对于这些细胞系能否在超出内毒素的多条模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR，先天免疫系统识别病原体相关分子模式的受体家族）通路上复现PBMC的功能行为，尚缺乏系统认知。这种空白可能导致基于内毒素比较的误判，因为若细胞系与原代系统之间的差异呈通路依赖性而非固定偏移，则内毒素质控数据无法外推至其他受体通路。
为回答上述问题，研究人员将来自三名健康供者的冷冻保存PBMC（Bioscience）等比例混合，与THP-1、HL-60和U937三种单核细胞系平行开展实验。研究采用10种分别靶向TLR1/2、TLR2、TLR2/6、TLR4、TLR5、TLR7、TLR7/8、TLR9及NOD2的热原配体，在完整剂量范围内进行刺激，通过酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA，定量检测样本中细胞因子水平的免疫学方法）检测18至20小时后的IL-6释放，并采用四参数Logistic模型拟合剂量–反应曲线。同时利用实时定量逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR，通过检测逆转录后cDNA扩增效率来定量分析基因转录水平的方法）测定各受体基础转录水平，并与Human Protein Atlas数据库的归一化转录本每百万（normalized transcript per million，nTPM，跨样本标准化后的基因表达丰度指标）数据进行比对。此外，系统评估了PBMC基MAT对每种刺激的检测限、精密度及内毒素等效效价。通过上述设计，研究得以在同一实验体系中原位比较原代与永生化系统的通路特异性响应差异。
Analytical performance of the PBMC-based monocyte activation test (MAT)
通过对PBMC基MAT的系统表征，发现内毒素（lipopolysaccharide，LPS，革兰氏阴性菌细胞壁外膜成分）的检测限为0.0003 ± 0.00007 EU/mL，定量限为0.0005 ± 0.00007 EU/mL，均为检测组合中最低。九种非内毒素热原的定量限跨越三个数量级，线性拟合度在六种刺激中优于r
2 = 0.98，其中imiquimod在检测浓度范围内未达到平台期，且定量限最高。
Endotoxin responsiveness reveals strong TLR4 signaling capacity in PBMCs
LPS刺激实验表明，PBMC呈现最强的IL-6反应，其剂量–反应曲线左移且动态范围最宽；HL-60所需内毒素浓度约高三个数量级，且在20 EU/mL范围内仍未达平台；THP-1在整个检测范围内反应微弱。RT-qPCR结果显示，三种细胞系的TLR4转录本均低于检测限，而PBMC可稳定定量。然而，HL-60在无TLR4转录本的情况下仍对内毒素产生响应，提示四种系统间的差异位于基础受体丰度水平的下游信号环节。
Evaluation of non-endotoxin pyrogen responses: TLR1/2 signaling
采用Pam3CSK4评估TLR1/2信号显示，PBMC的IL-6释放量最高达2,100 pg/mL，而THP-1、HL-60和U937即使在浓度提高1,000倍的条件下仍未超过180 pg/mL。TLR1转录本在三种细胞系中较PBMC低3至17倍，且Human Protein Atlas公开数据集呈现相同的排序趋势。
TLR2-mediated recognition of bacterial cell wall components
PGN-SA刺激下PBMC的IL-6反应最强（1,900 pg/mL），细胞系反应显著减弱。然而HKSA刺激出现了该面板中唯一的例外：HL-60产生670 pg/mL的IL-6，超过PBMC的230 pg/mL，而THP-1和U937分别低于50 pg/mL。TLR2转录本在细胞系中较PBMC低7至12倍，但两数据集对THP-1与HL-60的相对排序并不一致。
IL-6 responses to FSL-1 and flagellin
FSL-1刺激下PBMC反应最强（1,800 pg/mL），TLR6转录本在细胞系中较PBMC降低；鞭毛蛋白刺激下PBMC的IL-6释放达3,500 pg/mL，HL-60为290 pg/mL，THP-1和U937在检测范围内低于5 pg/mL。尽管TLR5转录本在三种细胞系中均不可检测，HL-60仍对鞭毛蛋白产生可测反应，表明基础转录水平本身不足以预测细胞的功能反应。
Different response patterns to TLR7 and TLR7/8 stimulation
TLR7选择性激动剂imiquimod仅诱导PBMC产生570 pg/mL的IL-6，THP-1和HL-60在所有测试浓度下均无反应。而TLR7/8双重激动剂CL075刺激下，PBMC反应最强（3,000 pg/mL），HL-60和U937分别为1,400和650 pg/mL，THP-1仅在最高浓度出现反应。TLR7和TLR8转录本在细胞系中较PBMC低4至100倍，且HL-60在imiquimod（无反应）和CL075（有反应）两种条件下均维持低转录水平，显示转录水平无法区分两种激动剂的功能差异。
Distinct activation pattern of the TLR9 pathway across monocytic systems
ODN2006刺激呈现独特的激活模式：PBMC的浓度依赖性IL-6增加在40 pg/mL处达到平台，而HL-60在最高测试浓度达57 pg/mL，超过PBMC；THP-1和U937反应微弱。HL-60的TLR9转录本为PBMC的2.9倍（p = 0.0016），是该检测组合中唯一细胞系转录水平显著高于PBMC的受体，两数据集均支持这一排序。
Differential NOD2-mediated responses to MDP in PBMCs and monocytic cell lines
MDP刺激下PBMC反应最强（810 pg/mL），HL-60平台期为100 pg/mL，THP-1和U937在同等浓度范围内低于3 pg/mL。NOD2转录本在细胞系中较PBMC低6至100倍，从受体转录到IL-6输出的四个系统排序保持一致。
讨论部分指出，PBMC对十种刺激中的九种产生反应，并在七种中产生最高的最大IL-6。原代与永生化单核细胞系统之间的差异并非恒定偏移，其幅度因通路而异，方向在HL-60中发生两次反转，分别见于HKSA和ODN2006刺激。HL-60对ODN2006的强反应可能与其停滞于早幼粒细胞阶段的发育特征有关，因TLR9在人外周血中主要限于浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells，pDCs，TLR9高表达并专司I型干扰素产生的免疫细胞）和B细胞，而HL-60携带的TLR9转录本较PBMC更高。然而，转录本丰度不能解释全部现象，功能性CpG识别还涉及寡核苷酸摄取、UNC93B1依赖的TLR9内体运输及酸性内体内的蛋白水解切割等步骤，研究人员未对此进行测定。对于HKSA，HL-60在TLR2转录本较PBMC低七倍的情况下反而表现出更强的反应性，提示差异存在于受体丰度以外的环节。重要的是，基于内毒素建立的系统排序无法预测非内毒素热原的排序，因相对效价跨越两个数量级（MDP为0.018 EEU/mL至HKSA为0.0002 EEU/mL，EEU为内毒素等效单位），且系统排序随污染物类别改变。PBMC与细胞系在细胞组成（PBMC中单核细胞为少数群体，伴随淋巴细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞，存在旁分泌放大效应）及永生化状态上存在差异，但细胞组成不能解释所有模式，如HL-60作为单一髓系群体却在TLR9和HKSA刺激中超过PBMC。
研究人员得出结论，对抗内毒素的反应性并不能预测对抗非内毒素热原的反应性。HL-60是三种细胞系中对内毒素反应最强的，但对两种脂肽激动剂最弱，且是唯一在HKSA和ODN2006刺激下超过PBMC的系统。因此，仅基于内毒素表征的细胞系对于其他每一类污染物都带有未知量级和方向的误差。由于非内毒素热原的检测是采用MAT的主要目的，因此细胞系应针对特定产品可能携带的相关污染受体通路进行确认。当该特征不明确时，PBMC因其对九种刺激均有反应而提供更广泛的选择。相反，细胞系保留了定义明确的细胞组成、无限供应及不受供体变异影响等优势，本研究数据既未涉及亦未否定这些优势。
