ω-3多不饱和脂肪酸抑制系统性红斑狼疮小鼠肾小球系膜细胞坏死性凋亡的作用与机制研究

《Autoimmunity》：ω-3 PUFAs inhibited necroptosis of mesangial cells in a mouse model of systemic lupus erythematosus

本研究旨在探讨ω-3多不饱和脂肪酸（ω-3 PUFAs）对系统性红斑狼疮（SLE）中系膜细胞坏死性凋亡的影响。研究人员采用16周龄雌性MRL/lpr小鼠作为SLE动物模型，随机分为三组：对照组、坏死性凋亡抑制剂治疗组和ω-3 PUFAs治疗组。每隔一天通过口服灌胃给予小鼠ω-3 PUFAs或等量生理盐水，持续4周。坏死性凋亡抑制剂治疗组小鼠每日腹腔注射Nec-1（一种坏死性凋亡抑制剂），持续3周。治疗后，收集脾脏和肾周淋巴结并称重。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清抗dsDNA抗体水平。定量检测血清肌酐、血尿素氮和尿蛋白水平。采用苏木精-伊红（H&E）染色和过碘酸雪夫（PAS）染色评估肾脏病理学变化。通过免疫荧光染色检测肾脏IgG和C3沉积。采用免疫荧光和蛋白质印迹法检测坏死性凋亡相关蛋白。用TNF-α、SM164和Z-VAD-FMK处理系膜细胞以诱导坏死性凋亡，然后分别补充ω-3 PUFAs或Nec-1。通过蛋白质印迹、免疫荧光染色和流式细胞术评估系膜细胞的坏死性凋亡。通过RT-qPCR检测系膜细胞的炎性细胞因子。ω-3多不饱和脂肪酸显著改善了MRL/lpr小鼠的SLE样症状，包括减轻脾肿大和淋巴结病、缓解肾脏病理和淋巴细胞浸润、减少肾脏免疫复合物沉积。血清肌酐、血尿素氮和尿蛋白水平显著下调。此外，ω-3 PUFAs治疗降低了MRL/lpr小鼠肾脏中的炎性细胞因子并抑制了系膜细胞的坏死性凋亡。体外实验表明，ω-3 PUFAs抑制了系膜细胞的坏死性凋亡并减少了炎性细胞因子的释放。结果表明，ω-3 PUFAs改善了SLE小鼠的症状并减弱了肾系膜细胞的坏死性凋亡。这些发现提示，ω-3 PUFAs可能代表了一种治疗SLE的新策略。

研究背景与科学问题

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种慢性系统性自身免疫性疾病，其特征是免疫系统攻击健康细胞和组织，常累及多个器官。狼疮肾炎（lupus nephritis，LN）是SLE最严重的器官表现之一，也是导致患者死亡的主要原因。LN的主要特征包括异常免疫复合物沉积、肾脏炎症细胞浸润、肾功能加速下降以及终末期肾病风险增加。系膜区是LN中免疫复合物沉积的主要部位之一，因此研究系膜细胞的生理特性对于肾脏疾病的治疗至关重要。目前LN的治疗通常依赖糖皮质激素、环磷酰胺或霉酚酸酯等免疫抑制剂，但部分患者对这些传统疗法反应不佳，导致疾病复发。因此，迫切需要探索LN的发病机制并寻找更有效、更安全的治疗策略。

程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）在维持机体稳态和炎症性疾病发展中发挥关键作用。坏死性凋亡（necroptosis）是一种由受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1，RIPK1）、受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3（RIPK3）和混合谱系激酶结构域样蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）激活介导的PCD形式。近年研究表明，坏死性凋亡在肿瘤、神经退行性疾病和自身免疫性疾病中发挥调控作用。在自身免疫性疾病中，其过度激活可诱导细胞裂解并释放大量损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs），破坏免疫耐受并驱动慢性炎症循环的持续放大。

ω-3多不饱和脂肪酸（ω-3 polyunsaturated fatty acids，ω-3 PUFAs）是在鲑鱼、鲭鱼等鱼类中发现的脂肪酸，包括二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）等。研究证实，ω-3 PUFAs可通过多种途径发挥免疫调节作用，包括抑制促炎细胞因子的产生和分泌、调节T和B细胞亚群的分化与功能失衡、阻断核因子κB（NF-κB）通路的异常激活以及抑制炎症小体的活化与组装。然而，它们在LN中的具体作用和分子机制尚未完全阐明。ω-3 PUFAs在程序性死亡中的调控作用仍知之甚少，特别是它们参与坏死性凋亡过程的具体机制值得探究。因此，研究人员旨在探讨ω-3 PUFAs对SLE的影响，并阐明其对系膜细胞坏死性凋亡的调控作用。

关键技术方法概述

研究人员采用16周龄雌性MRL/lpr小鼠（购自南京君科生物工程有限公司）作为SLE动物模型，随机分为对照组、坏死性凋亡抑制剂治疗组（Nec-1腹腔注射，3周）和ω-3 PUFAs治疗组（口服灌胃，4周）。体外实验使用小鼠肾小球系膜细胞（SV40 MES13，购自武汉普利赛斯生物科技有限公司），以TNF-α、SM164和Z-VAD-FMK（T/S/Z）诱导坏死性凋亡。主要技术方法包括：酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清抗dsDNA抗体；苏木精-伊红（H&E）和过碘酸雪夫（PAS）染色进行肾脏组织病理学分析；免疫荧光染色检测肾脏IgG和C3沉积及坏死性凋亡相关蛋白定位；蛋白质印迹法（Western blot）检测坏死性凋亡通路蛋白表达；流式细胞术（Annexin V-PE/7-AAD染色）定量分析细胞死亡类型；实时定量PCR（RT-qPCR）检测炎性细胞因子和坏死性凋亡相关基因mRNA水平；TUNEL染色检测细胞死亡。

研究结果

ω-3 PUFAs缓解了MRL/lpr小鼠的狼疮样症状

与对照小鼠相比，Nec-1和ω-3 PUFAs治疗小鼠的典型狼疮皮肤病变（如皮肤红斑和脱毛）均有不同程度的缓解。脾肿大在Nec-1或ω-3 PUFAs治疗后明显减轻。ω-3 PUFAs治疗显著改善了MRL/lpr小鼠肾周淋巴结的增大，而Nec-1治疗对此无显著影响。两组治疗均未显著改变肾脏重量。这些结果表明ω-3 PUFAs治疗改善了MRL/lpr小鼠的狼疮样症状。

ω-3 PUFAs减轻了MRL/lpr小鼠的肾脏病理损伤

H&E染色显示，MRL/lpr小鼠肾脏出现明显的血管周围炎性细胞浸润、肾小球体积显著增大、系膜基质增多和系膜细胞增殖。Nec-1或ω-3 PUFAs治疗后，肾脏炎症浸润显著减少，肾小球结构保持相对完整。PAS染色显示，MRL/lpr小鼠肾小球呈现典型的弥漫增生性病变，表现为肾小球体积增大、系膜基质显著扩张和基底膜增厚。Nec-1或ω-3 PUFAs干预后，肾小球系膜基质积累显著减轻，肾小球形态明显改善，细胞外基质沉积减少。免疫荧光染色显示，与对照小鼠相比，Nec-1和ω-3 PUFAs治疗小鼠的C3和IgG荧光强度显著降低，沉积区域减小，表明ω-3 PUFAs有效抑制了肾小球免疫复合物的形成和沉积。

ω-3 PUFAs减轻了MRL/lpr小鼠的肾功能障碍和炎症

与对照小鼠相比，Nec-1和ω-3 PUFAs治疗小鼠的尿蛋白、血清肌酐（CRE）和血尿素氮（BUN）水平显著降低。ELISA显示，Nec-1或ω-3 PUFAs治疗后血清抗dsDNA抗体水平下降。RT-qPCR检测结果显示，与对照小鼠相比，Nec-1或ω-3 PUFAs治疗显著降低了肾脏组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-17（IL-17）和干扰素-γ（IFN-γ）的mRNA水平。

ω-3 PUFAs抑制了SLE小鼠系膜细胞的坏死性凋亡

TUNEL染色显示MRL/lpr小鼠肾小球中存在大量阳性细胞，这一现象被Nec-1或ω-3 PUFAs显著抑制。免疫荧光共定位分析显示，MRL/lpr小鼠中磷酸化RIPK1（p-RIPK1）、磷酸化RIPK3（p-RIPK3）和磷酸化MLKL（p-MLKL）与系膜标志物PDGFRβ的共定位显著升高。Nec-1或ω-3 PUFAs治疗后，这些磷酸化蛋白在系膜细胞中的异常高表达被显著逆转。蛋白质印迹显示，与MRL/lpr小鼠相比，Nec-1组和ω-3 PUFAs组肾脏组织中p-RIPK1/RIPK1、p-RIPK3/RIPK3和p-MLKL/MLKL蛋白水平比值显著降低。qPCR也显示，Nec-1或ω-3 PUFAs干预后，肾脏组织中RIPK1、RIPK3和MLKL的mRNA表达显著降低。

ω-3 PUFAs在体外抑制了系膜细胞的坏死性凋亡

Hoechst染色显示，T/S/Z刺激的系膜细胞核出现明显的固缩和浓染，荧光强度显著增强，表明T/S/Z诱导了系膜细胞坏死性凋亡。Nec-1或ω-3 PUFAs抑制了这一过程。免疫荧光检测显示，T/S/Z刺激显著上调了系膜细胞表面p-MLKL的表达，而Nec-1或ω-3 PUFAs处理后p-MLKL荧光强度显著降低。流式细胞术定量分析显示，T/S/Z刺激诱导了系膜细胞坏死性凋亡（Annexin V^?7-AAD⁺细胞群），而Nec-1和ω-3 PUFAs干预显著逆转了这一效应。蛋白质印迹分析进一步验证，与T/S/Z刺激的细胞相比，Nec-1和ω-3 PUFAs处理组中p-RIPK1/RIPK1、p-MLKL/MLKL和p-RIPK3/RIPK3的比值显著降低。RT-qPCR也显示，Nec-1或ω-3 PUFAs处理显著降低了T/S/Z刺激诱导的RIPK1、RIPK3和MLKL的mRNA水平。

ω-3 PUFAs减少了系膜细胞的炎性细胞因子

RT-qPCR结果显示，T/S/Z刺激显著上调了系膜细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ的mRNA水平，而Nec-1或ω-3 PUFAs处理后这些细胞因子的mRNA水平显著下调。然而，ω-3 PUFAs和Nec-1对IL-10和IL-17的mRNA水平无显著影响。

讨论总结与研究结论

讨论部分指出，该研究通过体内和体外实验系统探讨了ω-3 PUFAs对SLE的保护作用及其潜在机制。结果表明，ω-3 PUFAs显著改善了MRL/lpr小鼠的SLE样表现、肾脏病理损伤和肾功能，同时降低了肾脏中的炎性细胞因子。机制研究表明，ω-3 PUFAs通过RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路抑制了肾小球系膜细胞的坏死性凋亡。细胞培养实验进一步证实，EPA和DHA直接抑制了T/S/Z诱导的坏死性凋亡并减少了系膜细胞中炎性细胞因子的释放。研究人员讨论了ω-3 PUFAs在自身免疫疾病领域的现有证据，指出其可能通过抑制促炎细胞因子合成、调节T/B细胞亚群、阻断NF-κB通路等多种途径发挥作用。该研究首次证明ω-3 PUFAs通过抑制RIPK1/RIPK3/MLKL介导的系膜细胞坏死性凋亡来减轻LN的肾损伤，为ω-3 PUFAs的肾脏保护作用提供了新的机制解释，也为靶向坏死性凋亡的治疗策略提供了实验支持。研究同时指出了局限性，包括ω-3 PUFAs是否影响其他形式的细胞死亡、是否直接调控RIPK1/RIPK3/MLKL上游信号分子，以及口服给药可能通过改变肠道菌群全局性地影响全身脂质和免疫谱等尚待进一步研究的问题。

研究结论：本研究表明，ω-3 PUFAs通过抑制RIPK1/RIPK3/MLKL介导的系膜细胞坏死性凋亡，减轻了LN小鼠的肾脏病理损伤并延缓了疾病进展。总之，这些发现拓展了研究人员对ω-3 PUFAs在肾脏疾病中生物学作用的理解。这项工作为SLE的治疗提供了一种新的策略。