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目的：TAK-981（Subasumstat）可抑制癌细胞生长并促进I型干扰素（IFN-Is）的产生。建立可靠的分析方法以测定人尿中TAK-981的浓度，对于其在肿瘤药物研发中的临床评价至关重要。
材料与方法：采用LC-MS/MS法，以稳定同位素标记的内标TA
目的：TAK-981（Subasumstat）可抑制癌细胞生长并促进I型干扰素（IFN-Is）的产生。建立可靠的分析方法以测定人尿中TAK-981的浓度，对于其在肿瘤药物研发中的临床评价至关重要。
材料与方法：采用LC-MS/MS法，以稳定同位素标记的内标TAK-981-13C4，15N2对TAK-981进行定量。样品从含0.05%吐温20的人尿中用乙腈（ACN）提取，并在ACQUITY HSS T3色谱柱上进行分析。
结果：该方法在10 ng/mL至2500 ng/mL浓度范围内按监管指南完成验证，并已应用于临床研究支持。在所有质控（QC）浓度下，批间相对误差（%RE）范围为?2.1%至2.3%，变异系数（%CV）范围为2.3%至3.0%。
结论：据研究人员所知，这是首个经过验证的用于人尿中TAK-981定量的LC-MS/MS方法的公开报道。
基于LC-MS/MS技术的人尿中Subasumstat（TAK-981）定量检测方法的建立与验证——论文解读
一、研究背景与意义
小泛素样修饰因子（SUMO）是一种小分子蛋白，通过SUMO化修饰过程调控细胞内多种蛋白的功能，包括改变蛋白活性、定位及与其他蛋白的相互作用。SUMO化在DNA修复、细胞周期进程、核质转运和转录调控等多种生物学过程中发挥关键作用。SUMO化活性异常与多种人类疾病相关，包括癌症、心血管疾病和神经退行性疾病。在血液系统恶性肿瘤如多发性骨髓瘤（MM）、白血病和淋巴瘤中，SUMO化通路常发生失调，驱动肿瘤发生、促进癌症进展并增强治疗耐药性。抑制SUMO化可触发自噬依赖性癌细胞死亡、抑制肿瘤细胞侵袭，并通过激活干扰素（IFN）信号通路增强抗肿瘤免疫，发挥双重作用机制。
TAK-981（Subasumstat）是一种强效、选择性、首创的小分子SUMO活化酶（SAE）抑制剂，通过将SUMO捕获在SAE活性位点形成SUMO-Subasumstat加合物，阻断SUMO向靶蛋白转移从而抑制SUMO化。该药物可激活I型干扰素信号通路、抑制癌细胞生长并增强抗肿瘤免疫，同时还能增强利妥昔单抗、5-氮杂胞苷、阿维鲁单抗、西妥昔单抗和曲美替尼等多种药物的抗肿瘤活性。
在肿瘤药物研发中，建立可靠的生物分析方法以测定人尿中TAK-981浓度对于其临床评价至关重要。LC-MS/MS技术因其高选择性、特异性和灵敏度被广泛应用于肿瘤药物研究中的药代动力学（PK）和药效学（PD）浓度定量。此前已有研究在研究人员实验室验证了人血浆中TAK-981的LC-MS/MS检测方法，但人尿中TAK-981的定量方法尚未见报道。
二、研究内容与结论
研究人员开发并验证了一种基于LC-MS/MS的人尿中TAK-981定量分析方法。该方法采用稳定同位素标记的TAK-981-13C4，15N2作为内标（IS），在10.0–2500 ng/mL浓度范围内按2018年美国食品药品监督管理局（FDA）监管指南完成全面验证。该方法已成功应用于两项临床试验的人尿样本分析，为TAK-981的临床研究提供了关键支持。这是首个经过验证的用于人尿中TAK-981定量的LC-MS/MS方法的公开报道，填补了该领域的空白。
三、主要关键技术方法
研究人员采用了以下关键技术方法：LC-MS/MS分析方法，使用Sciex API-4000三重四极杆质谱仪联用岛津高效液相色谱（HPLC）系统，采用多反应监测（MRM）模式正离子检测，监测TAK-981的m/z 578.1>481.2和IS的m/z 584.1>487.2离子对；使用ACQUITY HSS T3色谱柱（2.1×50 mm，1.8 μm）在60°C下进行色谱分离，流动相为含0.1%甲酸的水和乙腈；样品前处理采用乙腈蛋白沉淀法提取，含0.05%吐温20的人尿作为分析基质以克服非特异性结合问题；采用1/x2加权线性回归模型进行校准。人尿样本来源于IQVIA Laboratories（纽约州伊萨卡）。
四、研究结果
3.1 LC-MS/MS条件：在ACQUITY HSS T3色谱柱上实现色谱分离，总运行时间4.00分钟，TAK-981和IS的保留时间均为1.2分钟。
3.2 测定范围与灵敏度：方法验证建立了10.0–2500 ng/mL的标称浓度范围，足以满足临床样本定量需求。LLOQ样本（10.0 ng/mL）色谱图确认了方法在最低校准水平的灵敏度。
3.3 选择性与特异性：使用六批独立人尿评估，所有空白含IS样本中分析物响应比率均低于对应LLOQ样本的20%，IS响应均低于校准品和QC平均IS响应的5%，证明方法具有良好的选择性和特异性。
3.4 准确度与精密度：通过三个准确度和精密度（A&P）批次，每个QC水平六次重复评估。批内%RE范围为?3.2%至5.0%，%CV范围为0.8%至3.4%；批间%RE范围为?2.1%至2.3%，%CV范围为2.3%至3.0%，均符合监管验收标准。
3.5 运行验收QC样本：各补充验证批次中LQC、MQC和HQC样本结果均满足验收标准。
3.6 稀释完整性：12,500 ng/mL样本经10倍稀释后分析，批间%RE为?1.6%，%CV为4.1%，确认高于ULOQ至12,500 ng/mL的样本可可靠稀释定量。
3.7 稳定性评估：TAK-981在4°C下稳定至少24小时，经五次冻融循环稳定，在?20°C下稳定至少118天，在?70°C下稳定至少428天。提取后样本在4°C下稳定长达122小时，重新进样在4°C储存108小时后确认可行。
3.8 回收率：TAK-981总体回收率为83.0%，LQC为86.1%，MQC为83.1%，HQC为79.7%；IS平均回收率为90.9%。
3.9 基质效应：IS归一化基质因子LQC为0.88、HQC为0.91，个体值范围0.85–0.96，%CV<15%，表明存在一致的离子抑制效应但无显著基质效应影响准确度和精密度。
3.10 残留效应：ULOQ校准标准后立即注入提取空白样本，未检测到超过LLOQ平均响应20%的分析物峰或超过5%的IS峰，无显著残留。
3.11 运行时长评估：192次进样的扩展分析运行模拟常规临床样本分析时长，系统性能全程稳定无劣化。
3.12 非特异性结合评估：不含吐温20的QC样本两次转移后损失高达26.4%，含0.05%吐温20的样本损失可忽略，因此临床采集时需添加0.05%吐温20。
五、讨论与结论
该研究成功建立并验证了一种稳健、选择性强的LC-MS/MS生物分析方法，用于处理后人尿中TAK-981的定量。方法采用稳定同位素标记内标和MRM模式分析，1/x2加权回归构建线性校准曲线。该方法在10倍稀释后仍可可靠测定TAK-981，并证实了多种条件下的稳定性。该验证方法已成功应用于临床尿样分析，为TAK-981临床试验提供了支持。未来将开发并验证全血中TAK-981的相应生物分析方法，以进一步支持正在进行的临床研究。
