《Antioxidants》：Potential Involvement of Nrf2 in the Enhanced Antioxidant and Cytoprotective Effects of Quercetin and Kaempferol Following Their Exposure to a Nitrous Acid-Containing Pseudo-Gastric Fluid
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将槲皮素（Que）或山奈酚（Kae）暴露于含亚硝酸的模拟胃液（PGF）中，会导致其氧化转化为相应的羟基化苯甲酰苯并呋喃酮（BZFs），即Que-BZF和Kae-BZF。本研究评估了上述转化对这类液体在加入暴露于活性氧（ROS）生成剂吲哚美辛的Caco-2细胞时
将槲皮素（Que）或山奈酚（Kae）暴露于含亚硝酸的模拟胃液（PGF）中，会导致其氧化转化为相应的羟基化苯甲酰苯并呋喃酮（BZFs），即Que-BZF和Kae-BZF。本研究评估了上述转化对这类液体在加入暴露于活性氧（ROS）生成剂吲哚美辛的Caco-2细胞时，其抗氧化特性、细胞代谢活性和膜完整性的影响。向细胞中加入含Que-BZF或Kae-BZF的PGF，可浓度依赖性（10–100 nM）地阻止吲哚美辛诱导的氧化应激（二氯二氢荧光素氧化）、线粒体依赖性代谢功能障碍（MTT还原）和质膜破坏（LDH漏出）。为达到与PGF中10 nM Que-BZF或Kae-BZF所诱导的细胞内抗氧化保护（80%）、代谢保存（100%）和膜完整性保护（100%）相当的水平，需要槲皮素或山奈酚的浓度高达10 μM，即高出三个数量级。在100 nM时，PGF中所含的BZFs促进Nrf2核转位，并使抗氧化酶HO-1和NQO1的水平增加近五倍，无论是否经吲哚美辛处理。因此，本项体外化学模拟和肠上皮细胞模型研究表明，槲皮素和山奈酚在含亚硝酸的PGF中孵育后所经历的氧化转化，导致其原有抗氧化和细胞保护能力大幅增强，并提示后一种效应源于羟基化苯甲酰苯并呋喃酮激活Nrf2-Keap1通路的极强能力。
研究背景方面，黄酮类化合物（FL）的抗氧化作用是其健康促进效应中最常被关联的生物活性，其抗氧化机制包括激活Nrf2-Keap1通路以上调抗氧化酶合成，以及直接与ROS相互作用以清除或还原此类物种。前者为间接机制，主要由结构中含有α，β-不饱和羰基部分的FL展现；后者为直接但相对低效的ROS清除机制，由任何结构中带有至少一个酚羟基的FL分子展现。后一种作用方式的氧化还原后果意味着，一方面中和ROS的未配对电子，另一方面通过一系列氧化反应将FL分子转化为一种代谢物，该代谢物在很大程度上被认为丧失了FL原有的供电子或供氢能力。然而，近期有研究挑战了"黄酮类氧化必然损害其抗氧化特性"这一观点，证明至少对于黄酮醇类FL，氧化会产生一类代谢物——羟基化苯甲酰苯并呋喃酮（BZFs），其细胞内抗氧化效力显著高于其来源的黄酮醇。例如，槲皮素（Que）和山奈酚（Kae）氧化形成的Que-BZF和Kae-BZF，在暴露于ROS的细胞中测试时，其抗氧化效力比相应前体高出近1000倍。迄今为止，大多数展示Que-BZF和Kae-BZF抗氧化特性的研究均使用从碱性条件诱导黄酮醇氧化的溶液中分离或所含的BZFs。近期，Fuentes等报道，其前体黄酮醇在含亚硝酸盐的模拟胃液溶液中短时间孵育后可迅速形成Que-BZF和Kae-BZF。在胃液的酸性条件（pH 1–2）下，通过吞咽唾液持续到达胃部的亚硝酸盐迅速质子化，产生酚氧化物种亚硝酸。低微摩尔浓度的Que或Kae暴露于含亚硝酸盐的模拟胃液后所达到的Que-BZF和Kae-BZF浓度，等于甚至高于先前报道的保护肠上皮细胞免受ROS诱导的氧化和裂解损伤所需的浓度。基于上述结果以及Que-BZF和Kae-BZF的抗氧化效力远高于其前体黄酮醇这一事实，本研究旨在探究在含亚硝酸盐的酸性介质（如空腹条件下胃液中所存在者）中此类BZFs的形成和存在是否赋予该液体比仅存在其前体黄酮醇更大的抗氧化特性。为此，研究人员随后评估了其中形成Que-BZF和Kae-BZF的模拟胃液保护Caco-2细胞免受ROS暴露诱导的氧化应激、代谢损伤和膜完整性丧失的能力。此外，为阐明可能支撑此类含BZF液体细胞保护潜力的机制，研究人员评估了其促进Nrf2核转位以及诱导Nrf2相关抗氧化酶血红素加氧酶1（HO-1）和NAD(P)H醌氧化还原酶1（NQO1）合成的能力。
研究人员开展的研究表明，将低微摩尔浓度的Que或Kae在含生理浓度亚硝酸盐的模拟胃液中孵育，可快速且可重复地导致这些化合物部分转化为各自的羟基化苯甲酰苯并呋喃酮Que-BZF和Kae-BZF，并将这些发现扩展至黄酮醇非瑟酮、杨梅素和桑色素。本研究最重要的贡献在于证明，对于Que和Kae的BZFs，这些化合物在PGF中的形成和存在赋予其抗氧化能力超过其前体黄酮醇高达三个数量级。这不仅表现为逆转Caco-2细胞中INDO诱导的氧化应激增加高达90%，还表现为对该试剂诱导的细胞代谢损伤和细胞膜完整性丧失的完全（100%）保护。这些效应在极低浓度的BZFs（10 nM至100 nM范围内）下观察到。上述抗氧化和细胞保护特性的增强似乎与两种BZFs促进Nrf2核转位并诱导HO-1和NQO1酶活性的能力有关。有趣的是，观察到两种BZFs均可促进Nrf2核转位，无论细胞氧化还原状态如何，无论在基础条件下还是在氧化应激存在下。这些发现外推至体内场景，至少对于肠上皮细胞，可能具有潜在相关性——在含有此类黄酮醇的食物到达胃腔后。近期研究表明，当其前体黄酮醇与其他酚类化合物（如儿茶素、表儿茶素、没食子酸或原儿茶酸）共存于模拟胃环境时，Que-BZF和Kae-BZF的形成显著增强。这一发现提出了以下可能性：摄入除Que或Kae外还含有这些化合物的食物后，本文报道的胃液抗氧化特性的体外放大效应可能更高。
研究人员采用的关键技术方法包括：采用HPLC-DAD对模拟胃液中Que、Kae及其相应BZFs进行定量分析，色谱分离在Kromasil 100-5-C18柱上进行，流动相为乙腈和0.1%甲酸水溶液梯度洗脱；采用HPLC-DAD-ESI-MS/MS对非瑟酮、杨梅素和桑色素经亚硝酸诱导氧化产生的BZFs进行化学结构鉴定，使用Waters SYNAPT XS质谱仪在负离子模式下采集数据；使用Caco-2人结肠腺癌细胞（ATCC? HTB-37?，第10–20代）作为肠上皮细胞模型，以DCFH2-DA作为ROS敏感性荧光探针评估细胞内氧化状态，以MTT还原评估线粒体代谢活性，以LDH漏出评估细胞膜完整性；采用Nrf2转录因子测定试剂盒定量核组分中Nrf2水平，采用ELISA试剂盒测定HO-1水平，采用NQO1活性测定试剂盒评估NQO1活性。样本队列来源为Caco-2细胞系，购自ATCC。
研究结果方面，3.1 槲皮素和山奈酚前体黄酮醇与亚硝酸盐孵育后羟基化苯甲酰苯并呋喃酮的形成：通过HPLC-DAD色谱分析证实在37 °C下将Que或Kae（10 μM）与亚硝酸盐（50 μM）孵育30分钟后形成了各自的BZFs；在无亚硝酸盐条件下Que和Kae水平保持恒定，表明仅暴露于酸性介质不导致其降解；在含亚硝酸盐的PGF中孵育后，Que浓度降低5.8 μM，Kae浓度降低3.0 μM，同时定量到1.7 μM Que-BZF和0.6 μM Kae-BZF的形成；Que的转化程度（29.3%）略高于Kae（20.0%）；此外，本研究首次鉴定了非瑟酮、杨梅素和桑色素在与Que和Kae所用相同的PGF中孵育后形成其BZFs，ESI-MS/MS分析的分子离子[M-H]及其鉴定转换与Arias-Santé等在碱性介质中生成这些BZFs时报道的数据高度一致。3.2 槲皮素和山奈酚羟基化苯甲酰苯并呋喃酮的抗氧化效应：通过DCFH2-DA荧光探针在暴露于ROS生成剂INDO（325 μM）的Caco-2细胞中评估PGF的抗氧化能力，发现含1 nM Que-BZF的PGF将INDO诱导的氧化应激降低23%，10和50 nM时分别达到80%和83%的保护，100 nM时最大保护效力为90%，但150 nM时不仅丧失保护作用反而使INDO诱导的氧化应激增加37%；含100 nM Que-BZF的PGF保留残余Que浓度250 nM，而含250 nM纯Que的无亚硝酸盐PGF未提供保护，纯Que需10,000 nM才能达到80%保护，表明氧化代谢物的抗氧化效力比其黄酮醇前体高1000倍；对于Kae-BZF，含0.1 nM的PGF提供20%保护，1和10 nM时分别增至35%和88%，50 nM时最大保护效力为92%，100 nM时进入平台期，150 nM时引发促氧化反应使氧化应激增加12%；含100 nM Kae-BZF的PGF保留残余Kae浓度1200 nM，该浓度纯Kae无活性，纯Kae需10,000 nM才提供78%保护而Kae-BZF仅需5 nM即达到类似保护程度，表明氧化代谢物比其前体效力高2000倍；使用HPLC-DAD系统连接的馏分收集器制备选择性去除Que-BZF或Kae-BZF峰的PGF池，在基础和ROS诱导条件下均未引起相对于对照细胞的显著变化，强烈提示PGF所显示的保护能力主要由所形成的相应BZFs驱动。3.3 槲皮素和山奈酚羟基化苯甲酰苯并呋喃酮对线粒体代谢活性和细胞膜完整性的保护作用：通过MTT还原评估线粒体依赖性代谢功能，发现INDO导致细胞MTT还原能力下降50%，含10 nM Que-BZF或Kae-BZF的PGF完全消除了这种损伤，50和100 nM时完全保护得以维持，但150 nM时两种BZFs的保护作用完全丧失并观察到代谢损伤的轻微加重（约5%）；通过LDH漏出监测质膜完整性，发现含10 nM BZFs的PGF对INDO诱导的LDH释放升高提供完全保护，50和100 nM时细胞保护效应保持最大，但150 nM时Que-BZF和Kae-BZF未能提供保护反而分别使INDO诱导的细胞完整性丧失加重约15%和6%。3.4 槲皮素和山奈酚羟基化苯甲酰苯并呋喃酮对Nrf2活性及相关抗氧化酶的影响：3.4.1 Nrf2活性——通过Nrf2转录因子测定试剂盒评估Nrf2核转位，发现与PBS处理的对照细胞相比，单独INDO未改变Nrf2活性；在INDO存在下，含100 nM Que-BZF或Kae-BZF的PGF分别诱导Nrf2活性显著增加29.5%和25.2%；值得注意的是，这些BZFs在无INDO条件下也将Nrf2活性上调至相似程度（分别27.3%和25.6%）；两种代谢物之间无显著差异表明其结构差异并非Nrf2诱导效力的主要决定因素；纯Que和Kae尽管具有相同的取代基，但在250和1200 nM（分别为其相应BZFs浓度的2.5倍和12倍）下未能改变Nrf2活性，排除了BZFs诱导的Nrf2激活部分或全部由其前体黄酮醇驱动的可能性；100 nM Que-BZF在暴露于325 μM INDO的Caco-2细胞中激活Nrf2的能力与在大鼠胃和十二指肠黏膜中共同给予INDO和以Que-BZF标准化的洋葱水提取物所诱导的Nrf2激活一致；100至1000倍的浓度差异可能与黄酮醇C环在氧化转化过程中经历的结构转变有关，该分子重构导致BZFs中形成α，β-不饱和羰基（部分定位于B环内），而其黄酮醇前体中不存在此基团，BZF骨架中该环外羰基的存在使B环α，β-碳上相邻双键的电子密度离域，从而赋予β-位碳强烈的亲电特性，使其能够与Keap1中关键半胱氨酸残基的硫醇基共价结合，阻止Nrf2的泛素化和蛋白酶体降解，促进其释放和随后的核转位。3.4.2 抗氧化酶活性——通过ELISA和活性测定试剂盒评估HO-1和NQO1，发现INDO处理未引起任一参数的显著变化；含100 nM Que-BZF的PGF使HO-1水平在INDO存在和不存在下均显著增加约3.4倍，含100 nM Kae-BZF的PGF产生类似效应（约3.3倍）；含100 nM Que-BZF的PGF使NQO1活性在INDO存在下增加5.6倍、无INDO下增加5.2倍，含100 nM Kae-BZF的PGF使NQO1活性在INDO存在下增加5.2倍、无INDO下增加4.8倍，两种条件间无统计学显著差异；因此本研究首次报道了两种BZFs在体外均能同等程度地增加HO-1水平和NQO1活性，无论应激源是否存在。
讨论部分总结了本研究的局限性：BZFs的抗氧化和细胞保护效应仅在体外人类肠道细胞模型（Caco-2）中评估且暴露时间短，不能完全复制复杂的体内多器官相互作用或长期生理暴露；缺乏人体临床证据仍是一项局限，这些发现代表稳健的生化推断而非直接的临床外推；所观察到的细胞保护表现出狭窄的生物学窗口，在升高浓度阈值（150 nM）下保护效应丧失并观察到潜在不良反应或细胞反应性缺乏；未来需要进行体内研究和临床试验以确定在模拟胃介质中形成的这些代谢物的确切安全限值。含Que-BZF和Kae-BZF的PGF不仅在基础条件下促进Nrf2核转位还促进其抗氧化酶合成的能力，提示这些化合物可能促进一种细胞"启动"效应，通过该效应细胞获得氧化还原优势，先于ROS生成剂诱导的氧化应激的最终增加；尽管有证据表明Nrf2的基础过度激活在某些肿瘤阶段可能适得其反，但两种BZFs促进Nrf2核转位所需的极低浓度（100 nM）提示，至少在肠上皮细胞中，这些化合物通过调节基础氧化状态的稳态通路发挥作用，而不一定是在对氧化应激的响应中发挥作用。研究结论部分翻译如下：本项体外化学模拟和肠上皮细胞模型研究证实，将低微摩尔浓度的Que或Kae在含生理浓度亚硝酸盐的模拟胃液中孵育，可快速且可重复地导致这些化合物部分转化为各自的羟基化苯甲酰苯并呋喃酮Que-BZF和Kae-BZF，并将这些发现扩展至黄酮醇非瑟酮、杨梅素和桑色素。本研究最重要的贡献在于证明，对于Que和Kae的BZFs，这些化合物在PGF中的形成和存在赋予其抗氧化能力超过其前体黄酮醇高达三个数量级。这不仅表现为逆转Caco-2细胞中INDO诱导的氧化应激增加高达90%，还表现为对该试剂诱导的细胞代谢损伤和细胞膜完整性丧失的完全（100%）保护。这些效应在极低浓度的BZFs（10 nM至100 nM范围内）下观察到。上述抗氧化和细胞保护特性的增强似乎与两种BZFs促进Nrf2核转位并诱导HO-1和NQO1酶活性的能力有关。有趣的是，观察到两种BZFs均可促进Nrf2核转位，无论细胞氧化还原状态如何，无论在基础条件下还是在氧化应激存在下。这些发现外推至体内场景，至少对于肠上皮细胞，在含有此类黄酮醇的食物到达胃腔后可能具有潜在相关性。近期研究表明，当其前体黄酮醇与其他酚类化合物（如儿茶素、表儿茶素、没食子酸或原儿茶酸）共存于模拟胃环境时，Que-BZF和Kae-BZF的形成显著增强。这一发现提出了以下可能性：摄入除Que或Kae外还含有这些化合物的食物后，本文报道的胃液抗氧化特性的体外放大效应可能更高。
