# G4配体190在内分泌敏感及内分泌抵抗性luminal型乳腺癌细胞中抑制CHK1与ERα

《Cell Cycle》：G-quadruplex ligand-mediated CHK1 and ERα suppression in endocrine-sensitive and endocrine-resistant luminal breast cancer cells

　　

G-四链体（G-quadruplex, G4）稳定配体是抑制肿瘤细胞生长的有前景工具，在体外和体内模型中均得到验证。G4稳定化干扰DNA复制，导致复制应激（replication stress, RS）和DNA损伤，并影响基因表达。靶向端粒的G4配体RHPS4因心脏毒性而终止临床开发，促使合成保留活性且毒理学特征改善的同类物。本研究在乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231和HCC1937中检测RHPS4衍生物的抗增殖作用，并与非致瘤性乳腺上皮细胞及正常成纤维细胞进行比较。在多种类似物中，化合物190优先抑制MCF7细胞增殖，该效应与端粒DNA损伤弱相关。与RHPS4类似，化合物190以剂量依赖方式诱导RS、下调CHK1，并降低ESR1 mRNA及ERα蛋白水平。转录本水平降低与ERα降解增强提示转录与翻译后两种机制共同参与，其中降解可能与RS相关。上述效应在内分泌抵抗性MCF7-Y537S细胞中亦获证实。总之，这些发现确定CHK1与ERα抑制为化合物190的应答反应，并支持进一步研究吖啶类G4配体在内分泌敏感及内分泌抵抗性luminal型乳腺癌中的应用。

**一、研究背景与科学问题**

富鸟嘌呤序列可在生理条件下自发形成热力学稳定的非经典二级结构——G-四链体（G-quadruplex, G4），其存在于DNA及RNA（mRNA与lncRNA）中，具有广泛的结构多态性。端粒是最早被研究的生物学相关G4形成序列之一，由串联富G重复序列（脊椎动物为5'-TTAGGG-3'）构成。近二十年来，针对端粒G4的小分子配体因其抑制端粒酶及使端粒功能失调的能力，成为抗肿瘤研究的重要工具。端粒G4配体可导致复制叉停滞/崩塌、DNA损伤、细胞周期阻滞，并在体外抑制高增殖肿瘤细胞及肿瘤干细胞的生长，而对正常原代细胞效果较弱，多项体内研究亦证实其可实现肿瘤控制与消退。

五环吖啶类化合物RHPS4是其中尤为有效的G4配体，可阻断端粒处复制叉，诱导DNA损伤、增殖受损与细胞死亡；但其亦存在脱靶效应，可结合端粒外G4，如基因启动子（如编码VEGFR-2的KDR）及基因体（如编码CD133的PROM1）中的G4。既往在胶质瘤与骨肉瘤细胞中的研究显示，RHPS4可抑制复制应激反应（replication stress response, RSR）核心激酶CHK1的表达。CHEK1过表达在乳腺癌（breast cancer, BC）及宫颈癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、黑色素瘤和胶质母细胞瘤中普遍存在，多因癌细胞中启动子过度激活所致，并与预后不良及放化疗抵抗相关。其可能解释是，过表达CHEK1的癌细胞因对癌基因激活所致RS的应答能力增强及对治疗药物所致DNA损伤修复能力增强而在肿瘤进展中被正选择。CHK1是包括BC在内的潜在治疗靶点，CHK1抑制剂prexasertib与MK-8776已在乳腺癌临床前研究中评估并进入多种恶性肿瘤的I/II期临床试验。此外，G4稳定化合物对同源重组（homologous recombination, HR）缺陷细胞（如BRCA1、BRCA2、RAD51缺陷细胞）具有毒性，包括对PARP抑制剂（PARPi）耐药者。近期证据提示CHK1抑制剂影响luminal A与luminal B型BC细胞中雌激素受体α（estrogen receptor α, ERα）的稳定性与含量。

luminal A与B型BC通常表达ERα，患者一般接受以内分泌治疗（endocrine therapy, ET）药物靶向ERα信号，经典药物包括芳香化酶抑制剂（aromatase inhibitor, AI，如阿那曲唑）、选择性ERα调节剂（selective ERα modulator, SERM，如4OH-他莫昔芬）及选择性ERα下调剂（selective ERα downmodulator, SERD，如氟维司群）。然而约20–30%病例在长期ET后出现耐药。获得性ET耐药的机制之一是激活型ESR1突变（如Y537S）的选择，其驱动治疗抵抗与疾病复发。尽管RHPS4临床前特征良好，但因在豚鼠中观察到心脏毒性而从未进入临床试验；此后已开发出脱靶效应降低、安全性改善的RHPS4新衍生物，并在结直肠癌细胞及SV40永生化成纤维细胞中表征。从化学与结构角度，这些类似物保留RHPS4相同的芳香环，但在五环吖啶鎓核心2位与3位引入多种取代基以调节活性。本研究测试三种RHPS4同类物190、761与785（原分别命名为化合物2、6、8）在代表不同BC亚型的细胞组中的抗增殖能力，并选择最具前景的化合物190进行深入生物学表征。

**二、主要关键技术方法**

研究人员采用磺酰罗丹明B（SRB）法于120 h评估细胞增殖并计算IC₅₀；采用以2号染色体着丝粒为内参的定量荧光原位杂交（Q-FISH）测定端粒长度，并以TRF1与γH2AX共免疫染色检测端粒功能障碍诱导灶（TIF）；采用蛋白免疫印迹（WB）与逆转录实时定量PCR（RT-qPCR，2^?ΔΔCt法）检测蛋白与mRNA水平；采用G4Hunter生物信息学预测启动子 putative G4形成序列（PQS），并以圆二色谱（CD）、CD/UV熔解及热力学分析表征G4拓扑与配体稳定化（ΔT_m）；采用BG4抗体染色质免疫沉淀（ChIP）联合qPCR检测染色质内G4。细胞模型包括MCF7、MCF7-Y537S（CRISPR/CAS9构建的表达ERα Y537S变体细胞）、MDA-MB-231、HCC1937、MCF10A与MRC5；CHEK1表达及无复发生存（RFS）分析基于TCGA/TNMplot公共数据库（乳腺癌1097例、非癌493例）。

**三、研究结果**

**RHPS4及其类似物在BC细胞系中的细胞毒性效应** 通过SRB法检测0.1–8 μM范围内三种衍生物对BC及正常细胞系的作用，发现几乎所有癌细胞生长呈浓度依赖性抑制，MCF7细胞对配体最敏感（IC₅₀ 0.25–4 μM），三阴性（TNBC）细胞系耐药性最高、IC₅₀与正常细胞系相当；因190在所有细胞系中IC₅₀最低，遂选其深入表征。

**化合物190与RHPS4处理BC细胞系后的端粒长度、DNA损伤及端粒功能障碍** 通过Q-FISH测得MCF7、MDA-MB-231、HCC1937与MCF10A平均基础端粒长度分别为15.2、16.1、36.5与17.5 T/C%，并分析短端粒频率分布；经γH2AX与TRF1共免疫染色发现RHPS4在几乎所有BC细胞系中诱导基因组与端粒DNA损伤（MCF7、HCC1937、MDA-MB-231基因组损伤分别增加2.6、1.4、1.6倍，端粒损伤增加3.8、1.95、1.3倍），而MCF10A未见损伤；190除HCC1937基因组损伤与MCF7端粒损伤外基本不诱导DNA损伤，遗传毒性较弱；IC₅₀与平均端粒长度或短端粒频率仅弱相关，但基础γH2AX灶与TIF频率与G4配体耐药性正相关。

**RHPS4与190降低MCF7细胞CHK1蛋白水平** 通过WB观察到RHPS4使MCF7与HCC1937细胞CHK1分别下调约40%与60%，190作用相当（分别降低48%与38%）；以S期特异蛋白PCNA及BrdU细胞周期分析排除S期耗竭所致，仅见S期细胞轻度减少与细胞周期进程整体延迟；在MCF10A中190未降低CHK1，而RHPS4显著降低CHK1但PCNA亦强烈耗竭，提示其CHK1减少依赖S期阻断；BC细胞系中CHK1蛋白下降伴随CHEK1 mRNA表达降低。

**RHPS4与190在MCF7细胞中引发复制应激反应** 通过检测RPA与H2AX磷酸化状态发现，1 μM与4 μM RHPS4强烈激活RPA在Ser33、Ser4–8与Thr21位点的磷酸化，190激活较弱但呈显著剂量依赖增加（1 μM时S4_8，4 μM时S33、S4_8与T21）；γH2AX的WB结果与免疫荧光一致，显示RHPS4作用更强。

**CHEK1在BC中过表达并与BC患者无复发生存相关** 基于TCGA数据的分析显示CHEK1 mRNA在多种肿瘤中高于正常组织，BC组织（1097例）高于非BC组织（493例）；生存分析显示高CHEK1水平与ERα阳性BC患者RFS负相关，而ERα阴性患者呈相反趋势。

**RHPS4与190诱导MCF7细胞ERα耗竭** 通过WB检测发现两配体均剂量依赖性降低ERα，RHPS4在0.25 μM即显著而190需1 μM（二者IC₅₀约0.4与1.2 μM，与抗增殖效应相关），并伴RPA与γH2AX磷酸化；CHK1抑制剂prexasertib亦降低ERα；环己酰亚胺（CHX）预处理后的蛋白周转实验显示两配体引起显著的CHX依赖性ERα减少，提示翻译后调控；RT-PCR显示RHPS4（1 μM）与190（4 μM）显著下调ESR1基因表达，提示转录与翻译后双重调控。

**RHPS4与190在ET耐药转移性BC模型细胞系中降低CHK1与ERα水平** 通过SRB法显示MCF7-Y537S细胞对RHPS4与190敏感性相当（IC₅₀约1 μM），且对190的敏感性高于TNBC与对照细胞；WB与RT-qPCR显示两配体显著降低CHK1蛋白与mRNA而不影响PCNA或耗竭S期；并以蛋白（RHPS4与190的IC₅₀约0.3与1.6 μM）与mRNA水平证实剂量依赖性ERα降低，CPT与prexasertib作为RS诱导与CHK1抑制对照。

**CHEK1与ESR1启动子含可折叠为G4结构的序列** 通过生物信息学（G4Hunter）鉴定CHEK1（5′-GGGACGGGTGGGGCTGTGGATGGGA-3′）与ESR1（5′-GGGAGGGAGGGAGGGAGGGAGAAGGG-3′）启动子PQS，CD谱显示CHEK1为混合型拓扑（264 nm正峰、290 nm肩峰、240 nm负峰），ESR1为平行型拓扑，且椭圆率随K⁺浓度增加；主成分分析（PCA）显示ESR1与平行型G4聚类、CHEK1与混合型G4（如2JSM、2HY9）邻近；CD与UV熔解测得一致T_m，热力学参数（ΔH°≈?50至?56 kcal mol^?1；ΔS°≈?140至?170 cal mol^?1 K^?1）符合G4形成特征，确立二者为热力学稳定、K⁺依赖性G4结构。

**RHPS4与190结合CHEK1与ESR1启动子G4结构** 通过CD熔解实验（ESR1用10 mM KCl、CHEK1用20 mM KCl，22AG端粒G4为参照，其T_m为56.05±0.07°C）评估4当量配体的稳定化，发现RHPS4强烈稳定22AG（ΔT_m≈30°C）而对ESR1（≈15°C）与CHEK1（≈12°C）作用中等；761与785对ESR1（ΔT_m达30°C）与CHEK1（≈20°C）稳定显著而对22AG作用减弱；190表现最佳平衡，对ESR1与CHEK1的ΔT_m≈16°C而对端粒对照仅≈6°C，提示其保留核心G4结合能力但降低端粒脱靶亲和；BG4 ChIP-qPCR显示CHEK1启动子DNA在BG4沉淀中显著富集（与阳性对照MDM2相当），且RHPS4与190处理进一步增强富集。

**四、讨论与结论**

讨论部分指出，RHPS4因豚鼠体内剂量相关的心率下降与QTc间期缩短而中止临床开发，新衍生物在保留五环吖啶鎓核心的同时于2、3位引入取代基以降低心脏毒性。本研究中RHPS4的平均IC₅₀与既往BC数据相符，ERα阳性MCF7最敏感，而BRCA1突变的HCC1937与MDA-MB-231较耐药，后两者伴更高的基础γH2AX水平（为MCF7的3–4倍），与TNBC化疗反应差及预后不良的报道一致。所有配体对MCF7的活性均高于非致瘤性MCF10A与MRC5，而TNBC细胞敏感性接近对照。190虽被报道与其前体药理特征相同，但本研究显示其在BC细胞中诱导DNA损伤的能力较弱，因而促使其机制研究转向CHEK1等已知RHPS4靶基因的转录状态。CHEK1过表达与BC生存率降低及HR活性增强、治疗抵抗相关，抑制CHEK1或可增强现有治疗疗效并恢复HR缺陷肿瘤对PARPi的合成致死性。本研究将RHPS4降低胶质瘤CHK1的观察扩展至BC细胞，且伴有CHEK1 mRNA下降；生物物理与BG4 ChIP结果支持配体稳定CHK1启动子G4从而促进其转录下调的模型，但该下调未在BC细胞中转化为可检测的X射线增敏效应。CHK1亦与激素受体状态及内分泌耐药相关，CHK1抑制剂可促进ERα降解，且RS（而非DNA损伤）的诱导足以降低ERα水平。本研究中两化合物剂量依赖性降低MCF7的ERα蛋白与ESR1 mRNA，结合蛋白周转实验提示受体下调涉及基因表达与蛋白稳定性两方面，但未能确定其是否由CHK1下调介导或各机制的相对贡献与独立性；该应答在依赖受体信号的Y537S ET耐药模型中同样保留。生物信息学与CD结果显示ESR1启动子G4可被两配体稳定，提示启动子G4稳定可能参与ESR1下调，并与CHEK1下调及RS所致ERα失稳共存。重要的是，RHPS4类似物对CHEK1与ESR1启动子G4的稳定能力存在差异，190对二者均有效稳定而对端粒22AG影响极小，体现序列与拓扑选择性增强，与细胞数据一致。总体而言，研究将化合物190定位为开发对调控性启动子G4具有更佳特异性的下一代G4配体的有前景分子，此类化合物或可实现对致癌转录程序的更靶向调控，为luminal型及内分泌抵抗性乳腺癌提供新的治疗机会。

研究结论（翻译）：总之，这些发现确定CHK1与ERα抑制为化合物190的应答反应，并支持进一步研究吖啶类G4配体在内分泌敏感及内分泌抵抗性luminal型乳腺癌中的应用。