新疆褐牛源β-防御素EBD缓解粪肠球菌诱导的小鼠乳腺炎症

《Cells》：Xinjiang Brown Cattle-Derived β-Defensin EBD Alleviates Enterococcus faecalis-Induced Mammary Inflammation in Mice

　　

摘要：奶牛乳腺炎是奶牛养殖业的主要传染病，而抗菌药物耐药病原体的日益流行使得开发有效抗菌剂的需求十分迫切。在本研究中，研究人员从新疆褐牛中克隆、表达了牛肠道β-防御素（enteric β-defensin, EBD），并初步评估了其对粪肠球菌（Enterococcus faecalis）诱导的乳腺炎的抗菌和保护作用。生物信息学分析将EBD鉴定为一种分泌蛋白，属于牛β-防御素家族。重组PCDH-EBD构建体成功转染至293T细胞中，导致EBD mRNA表达显著增加，并通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法确认了可检测的重组EBD蛋白表达。体外琼脂扩散试验显示，含EBD的制剂对粪肠球菌（E. faecalis）表现出抑制活性。在小鼠乳腺炎模型中，与乳腺炎组相比，EBD处理显著减轻了乳腺组织病理学损伤，并降低了髓过氧化物酶（Mpo）、肿瘤坏死因子（Tnf）和白介素6（Il6）的表达。乳腺组织的16S rRNA测序显示，EBD处理与肠球菌（Enterococcus）相对丰度的降低以及微生物多样性的部分恢复相关。转录组学分析进一步揭示，EBD处理与NOD样受体信号通路和吞噬体相关通路的改变有关，表明这些过程可能有助于其保护作用。综上所述，这些发现表明来自新疆褐牛的肠道β-防御素EBD具有抗菌和抗炎潜力，使其成为开发抗奶牛乳腺炎抗菌剂的候选分子。

论文解读：新疆褐牛源β-防御素EBD缓解粪肠球菌诱导的小鼠乳腺炎症

一、研究背景与研究目的

奶牛乳腺炎是全球奶牛养殖业中最普遍且经济损失最大的传染病之一，严重影响产奶量和品质，增加兽医成本，并引发食品安全与公共卫生担忧。该病由多种传染性和环境性病原体引起，其中金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、链球菌属（Streptococcus spp.）、大肠杆菌（Escherichia coli）以及粪肠球菌（Enterococcus faecalis, E. faecalis）被认为是主要的细菌性病原。随着抗菌药物耐药性问题日益严峻，传统抗生素疗法的有效性大幅下降，同时乳制品中抗生素残留的风险也受到广泛关注。因此，开发安全有效的抗生素替代品成为预防和控制奶牛乳腺炎的重要研究方向。

粪肠球菌是一种机会性病原体，其毒力因子、生物膜形成能力和抗菌药物耐药性使感染控制复杂化。β-防御素（β-defensins）是哺乳动物先天免疫系统中的重要阳离子抗菌肽，除了直接抗菌活性外，还具有调节炎症反应、招募免疫细胞和维护上皮屏障完整性的功能。牛肠道β-防御素（enteric β-defensin, EBD）作为β-防御素家族成员，其生物学功能，特别是针对粪肠球菌相关乳腺炎的保护作用尚不明确。新疆褐牛是适应新疆地区环境与饲养条件的本地培育品种。本研究旨在克隆并表达新疆褐牛源的EBD，评估其体外抗菌活性，并通过小鼠模型探究其对粪肠球菌诱导乳腺炎症的潜在保护作用。

二、主要关键技术方法

1. 1.
   基因克隆与真核表达载体构建：从新疆昌吉褐牛屠宰场采集新鲜牛组织，提取总RNA并反转录为cDNA。利用特异性引物扩增EBD编码序列，通过同源重组将其插入经双酶切线性化的真核表达载体PCDH中，构建重组质粒PCDH-EBD，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞并经菌落PCR和Sanger测序验证。
2. 2.
   细胞转染与重组蛋白表达鉴定：将重组质粒PCDH-EBD转染至人胚肾293T细胞，经嘌呤霉素筛选后，通过荧光显微镜观察GFP荧光、定量实时PCR（qRT-PCR）检测EBD mRNA水平，并采用SDS-PAGE和蛋白质印迹法（Western blotting）鉴定重组EBD蛋白表达。
3. 3.
   体外抗菌活性测定：采用琼脂孔扩散法，以临床分离的粪肠球菌及五种标准菌株（大肠杆菌ATCC 25922、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA ATCC 43300、肠炎沙门氏菌ATCC 13076）为靶标，评价含EBD制剂的抑菌活性，以卡那霉素为阳性对照。
4. 4.
   小鼠乳腺炎模型建立与处理：选用8周龄昆明小鼠，经自然交配后选取15只泌乳母鼠，随机分为阴性对照组（NC）、乳腺炎组（Mastitis）和EBD治疗组（EBD），每组5只。通过乳头管向第四对乳腺内注射粪肠球菌悬液（每腺体3.35×10⁵ CFU）建立感染模型，EBD组同时注射EBD蛋白（每腺体50 μg）。24小时后处死小鼠，收集乳腺组织进行后续分析。
5. 5.
   组织病理学分析：对乳腺组织进行苏木精-伊红染色，基于炎性细胞浸润、腺泡结构破坏、间质水肿和组织坏死四项指标进行盲法评分（每项0-3分，总分0-12分）。
6. 6.
   16S rRNA微生物组测序与分析：从每组各4只小鼠的乳腺组织中提取总DNA，扩增16S rRNA基因V3-V4区，在Illumina NovaSeq平台测序。利用QIIME2和ANCOM-BC2进行差异丰度分析。
7. 7.
   转录组测序与生物信息学分析：从每组各3只小鼠的乳腺组织中提取总RNA，构建文库并在Illumina NovaSeq平台测序。使用HISAT2比对到小鼠参考基因组，DESeq2鉴定差异表达基因（DEGs），并进行GO和KEGG富集分析。
8. 8.
   qRT-PCR验证：对代表性炎症、中性粒细胞募集、上皮屏障和凋亡相关基因（Tnf, Il1b, Il6, Cxcl1, Mpo, Tjp1, Ocln, Bcl2）进行定量PCR验证。

三、研究结果

1. 牛β-防御素EBD的克隆与生物信息学分析

通过同源重组成功构建全长8381 bp的重组质粒PCDH-EBD，菌落PCR筛选出4个阳性克隆。基因组定位分析显示EBD位于牛基因组的一个抗菌肽（AMP）基因簇内。理化性质分析表明EBD为疏水性非跨膜蛋白，N端具有典型信号肽，属于分泌蛋白。二级和三级结构预测呈现典型的β-防御素折叠特征。系统发育分析将EBD归类于牛β-防御素分支，与其它反刍动物β-防御素亲缘关系密切。

2. 重组质粒PCDH-EBD的细胞转染与SDS-PAGE分析

荧光显微镜观察到PCDH-EBD组与空载体PCDH组均显示相当的GFP荧光，表明转染成功。qRT-PCR证实PCDH-EBD组EBD mRNA表达显著高于空载体组（p < 0.001）。SDS-PAGE考马斯亮蓝染色显示PCDH-EBD组在约13 kDa处蛋白条带增强，光密度分析表明该蛋白表达显著升高（p < 0.01）。蛋白质印迹法在纯化的重组EBD-His标签蛋白中检测到约18 kDa的免疫反应条带，而空载体组无相应条带，证实重组EBD蛋白成功表达。

3. EBD的体外抗菌活性与体内保护作用

琼脂孔扩散试验显示，含EBD制剂对所有测试菌株均表现出不同程度的生长抑制活性，抑菌圈直径范围为9.52±0.18至15.78±0.22 mm。对粪肠球菌的抑菌圈最大（15.78±0.22 mm），其次是大肠杆菌ATCC 25922（15.14±0.13 mm）和金黄色葡萄球菌ATCC 29213（12.28±0.29 mm），表现为中度抗菌活性；对鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和MRSA的活性较弱。与卡那霉素阳性对照相比，EBD制剂对粪肠球菌的抑菌圈较小。

在小鼠乳腺炎模型中，体重监测显示各组间无显著差异。H&E染色组织学检查显示，乳腺炎组乳腺组织出现明显的中性粒细胞浸润、腺泡破坏、间质水肿和局灶性坏死，病变评分为8-9分；EBD处理组炎性细胞浸润减少，腺泡结构部分恢复，病变评分降至4-5分。统计分析表明，乳腺炎组病变评分显著高于对照组（p < 0.001），而EBD处理组评分显著低于乳腺炎组（p < 0.01）。

4. 牛肠道β-防御素对乳腺炎小鼠乳腺组织相关微生物群的影响

16S rRNA测序分析显示，在门水平上厚壁菌门和变形菌门为主要优势菌门。主坐标分析和成对Adonis分析表明，EBD组与乳腺炎组之间的微生物群落结构存在显著差异（pseudo-F = 6.5875, p = 0.030），而EBD组与对照组之间无显著差异（p = 0.158）。Alpha多样性分析显示，乳腺炎组的香农指数较对照组降低，而EBD处理组的香农指数高于乳腺炎组。ANCOM-BC2差异丰度分析识别出14个属在三组间存在显著差异。其中，肠球菌属（Enterococcus）在乳腺炎组中显著富集（相对于NC组，对数倍数变化LFC = 5.97, q = 0.0062），而在EBD组中相对丰度较乳腺炎组显著降低（LFC = 5.48, q = 0.0163），EBD组与对照组之间无显著差异。

5. 粪肠球菌诱导的小鼠乳腺炎经EBD处理后的乳腺转录组分析与qPCR验证

RNA-seq分析显示，与对照组相比，乳腺炎组有1574个基因显著上调、1029个基因下调；与乳腺炎组相比，EBD组有174个基因上调、260个基因下调。主成分分析显示三组样本明显分离，EBD组向对照组方向偏移。KEGG富集分析表明，乳腺炎组与对照组的差异基因显著富集于NOD样受体（NLR）、TNF信号通路和NF-κB信号通路等炎症免疫相关通路；EBD组与乳腺炎组的差异基因则富集于NLR信号通路、吞噬体相关通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、肌动蛋白细胞骨架调控和细胞黏附分子等通路。层次聚类热图显示，乳腺炎组促炎基因（Il6, Il1b, Tnf, Cxcl1）显著上调，EBD处理后表达降低。

qRT-PCR验证结果与转录组数据趋势一致：乳腺炎组促炎和中性粒细胞相关基因（Tnf, Il1b, Il6, Cxcl1, Mpo）mRNA表达显著升高，EBD处理显著降低其表达；而上皮屏障相关基因（Tjp1, Ocln）和抗凋亡基因（Bcl2）在乳腺炎组表达下降，EBD处理后部分恢复。

四、讨论与结论

讨论部分总结：本研究初步评估了新疆褐牛源重组EBD制剂的抗菌活性及其对粪肠球菌诱导小鼠乳腺炎症的保护作用。EBD制剂在体外抑制了多种细菌的生长，其与粪肠球菌共给药与减轻乳腺组织损伤和炎症基因表达相关。微生物组和转录组分析揭示了伴随的乳腺组织相关细菌组成和宿主应答通路的变化。然而，本研究的抗菌试验仅在单一浓度下进行，缺乏标准化效价和剂量-反应测量；动物实验样本量小、仅设24小时单一时间点且采用EBD与细菌同时给药方式，未包含空载体转染细胞制备的配方匹配对照组，限制了将观察到的效应完全归因于EBD。微生物组和转录组分析为探索性研究，未进行绝对细菌定量和靶向机制实验。未来需确定EBD对其他临床分离株的效力、延迟给药的疗效、在乳汁中的稳定性与活性，并进行细胞毒性、局部耐受性、制剂适宜性和食品安全性评估，最终需在泌乳奶牛中进行对照实验。

研究结论翻译：本研究克隆并表达了新疆褐牛源肠道β-防御素EBD，并证明含EBD制剂在体外对几种细菌菌株具有生长抑制活性。在粪肠球菌诱导的小鼠乳腺炎症模型中，该制剂共给药与减轻组织病理学损伤和降低炎症相关基因表达相关。微生物组和转录组分析确定了乳腺组织相关细菌组成和宿主应答通路的伴随变化。这些发现支持进一步研究EBD作为乳腺炎防治的潜在候选分子。然而，其特定的抗菌效力、对已确立感染的疗效、潜在机制以及在奶牛中的安全性和有效性仍有待确定。