Lacticaseibacillus rhamnosus OF44减轻去卵巢大鼠骨丢失并改善骨微结构、骨生物力学及肠道菌群关联

《Foods》：Lacticaseibacillus rhamnosus OF44 Attenuates Bone Loss in Ovariectomized Rats

　　

雌激素缺乏损害骨结构与机械性能，因此需要能够同时保持二者的干预措施。益生菌候选株Lacticaseibacillus rhamnosus OF44的骨健康效应尚未明确。研究人员在去卵巢（ovariectomized, OVX）大鼠中评价OF44，采用显微计算机断层扫描（micro-computed tomography, micro-CT）和生物力学测试评估骨骼结局，并结合血清检测、组织学、蛋白谱分析和16S rRNA基因测序表征伴随的生物学变化。30只雌性Sprague–Dawley大鼠被分配至Sham组、OVX组和OF44组（每组n=10；终末分析每组n=6）。OF44以5×10⁸ CFU/kg体重/天的剂量经口灌胃给予90天。与OVX对照相比，OF44处理大鼠的股骨骨密度（bone mineral density, BMD）更高（0.179 vs 0.132 g/cm³；+35.5%），骨小梁体积分数（trabecular bone volume fraction）更高（10.10% vs 7.01%；+44.1%），最大载荷（maximum load）更高（+17.7%）。这些改善伴随有利的血清骨转换谱、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP）阳性破骨细胞减少以及血清白细胞介素-10（interleukin-10, IL-10）升高。OF44处理还改变骨重塑相关蛋白表达和肠道微生物组成，包括Ruminococcaceae和S24-7/Muribaculaceae的富集。一致的结构与机械结局为OF44作为雌激素缺乏条件下骨健康的益生菌候选株提供了菌株特异性临床前证据。

研究背景：骨是持续重塑的动态组织，破骨细胞介导的骨吸收与成骨细胞介导的骨形成失衡可导致骨丢失并促进骨质疏松（osteoporosis, OP）发生。OP以骨量降低、骨微结构退变和骨折风险增加为特征，绝经和衰老相关雌激素缺乏在其中起关键作用。肠道菌群可通过代谢产物、宿主代谢通路和免疫功能调节骨代谢，靶向肠道菌群尤其是益生菌干预被认为具有缓解骨骼疾病的潜力。既往Guo et al.和Sapra et al.报道Lacticaseibacillus rhamnosus可缓解雌激素缺乏诱导的骨丢失，但益生菌效应具有菌株特异性；OF44的骨健康效应尚未确立，因此研究人员在OVX大鼠中评价OF44对股骨骨小梁结构和机械性能的影响，并结合血清、组织学、蛋白谱和16S rRNA基因测序分析伴随的生物学变化。

关键技术方法（≤250字）：研究使用3月龄SPF雌性Sprague–Dawley大鼠（购自Zhuhai BesTest Biological Technology Co., Ltd., Zhuhai, China），建立Sham、OVX和OF44组；OF44冻干制备获自BGI Precision Nutrition (Shenzhen, China)，以5×10⁸ CFU/kg体重/天灌胃90天。主要技术包括micro-CT分析股骨微结构，三点弯曲试验评估生物力学，酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测血清骨转换标志物和细胞因子，苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）与TRAP染色观察组织形态和破骨细胞，蛋白质印迹（Western blot）检测骨重塑相关蛋白，16S rRNA基因V3–V4区测序分析粪便菌群，并采用LEfSe、PERMANOVA、PERMDISP及Spearman相关进行统计分析。

研究结果：
3.1 OF44 Improved Femur Microstructure in OVX Rats（OF44改善OVX大鼠股骨微结构）：通过骨钙含量测定和micro-CT发现，OVX组骨钙含量低于Sham组；OF44组较OVX对照BMD、BV/TV、骨小梁数目（trabecular number, Tb.N）和连接密度（connectivity density, Conn.D）升高，结构模型指数（structure model index, SMI）降低，Tb.Sp、BS/BV和Tb.Th无显著差异。
3.2 OF44 Improved the Biomechanical Properties of the Femur in OVX Rats（OF44改善OVX大鼠股骨生物力学性能）：三点弯曲试验显示，OF44组较OVX对照最大载荷、弹性模量和最大弯曲应力升高，最大应变无显著组间差异。
3.3 OF44 Improved the Serum Bone Turnover Profile in OVX Rats（OF44改善OVX大鼠血清骨转换谱）：ELISA显示OF44组较OVX对照血清骨特异性碱性磷酸酶（bone-specific alkaline phosphatase, BALP）、骨钙素（osteocalcin, OCN）、I型前胶原N端前肽（procollagen type I N-terminal propeptide, PINP）和骨保护素（osteoprotegerin, OPG）升高，TRACP-5b和CTX-I降低；PICP和NTX无显著差异。
3.4 OF44 Increased Serum IL-10 in OVX Rats（OF44升高OVX大鼠血清IL-10）：OF44组血清IL-10高于OVX对照，TNF-α无显著组间差异。
3.5 Preserved Trabecular Histomorphology and Reduced Osteoclast Numbers in OVX Rats（OVX大鼠骨小梁组织形态保留且破骨细胞数减少）：H&E和TRAP染色显示OF44组骨小梁排列较OVX对照更有序，TRAP阳性破骨细胞数显著减少。
3.6 OF44 Modulated Bone-Remodeling-Related Protein Expression in OVX Rats（OF44调节OVX大鼠骨重塑相关蛋白表达）：Western blot显示OF44组较OVX组Wnt10b、β-catenin、Runx2、ALP和OPG表达升高，SOST、DKK1、RANKL、RANK、NFATc1和TRAP表达降低；p-GSK3β (Tyr216)无显著差异。
3.7 OF44 Altered Gut Microbial Diversity and Composition in OVX Rats（OF44改变OVX大鼠肠道微生物多样性和组成）：3.7.1 Gut Microbial Diversity and Community Composition：16S rRNA测序显示OF44组Simpson多样性、Allen熵和Rao二次熵高于OVX组；PCoA和PERMANOVA检测到组间群落差异，PERMDISP提示组内离散度异质；门水平上OF44组Firmicutes平均比例低于OVX对照，Bacteroidetes和Verrucomicrobia平均比例较高。3.7.2 Characteristic Taxa and Microbiota–Phenotype Associations：LEfSe显示OF44相关分类条目包括S24-7和Ruminococcaceae；43个层级分类条目满足LDA≥4且BH校正Kruskal–Wallis p<0.05。108个菌科–表型关联中41个在双侧置换检验和BH校正后显著，Ruminococcaceae与IL-10及BALP呈正相关，相关分析为探索性。

讨论部分总结：研究以Sham和OVX为对照确定OF44在5×10⁸ CFU/kg体重/天剂量下的骨骼反应；设计仅评价一个剂量且无药理对照，终末分析每组6只动物且未进行先验效力计算。菌群–表型相关合并18只动物，属探索性分析；BH校正后仍可能存在假阳性关联，组间差异、相对丰度组成性和笼相关依赖性可影响解释，置换检验为无限制置换。Western blot和16S测序分别表征蛋白丰度和分类组成，通路激活及微生物介导需直接功能测试；未评估GSK3β磷酸化与总GSK3β比值、激酶活性、β-catenin核定位、TCF/LEF依赖及经典Wnt靶转录、肠道屏障完整性和短链脂肪酸浓度。原文指出这些发现提示应优先开展剂量范围研究、通路特异性功能试验和靶向微生物干预以检验伴随骨骼益处的候选机制。

研究结论翻译：OF44减轻大鼠去卵巢诱导的骨丢失，相对OVX对照使股骨BMD增加35.5%、BV/TV增加44.1%、最大载荷增加17.7%。这些结构和力学获益伴随有利的骨转换标志物、TRAP阳性破骨细胞减少和循环IL-10升高。Wnt/β-catenin和RANKL/RANK/OPG相关蛋白谱及肠道微生物组成提供了相关生物学背景，包括OF44相关的Ruminococcaceae和S24-7/Muribaculaceae富集。一致性的骨骼结局为OF44作为雌激素缺乏条件下骨健康的益生菌候选株提供了菌株特异性临床前证据。