转谷氨酰胺酶交联胶原蛋白凝胶延缓胃肠道传输并延长抗氧化胶原源二肽与三肽的血清出现时间

《Nutrients》：Transglutaminase-Crosslinked Collagen Gel Delays Gastrointestinal Transit and Prolongs Serum Appearance of Antioxidant Collagen Di- and Tripeptides in Mice

　　

背景：转谷氨酰胺酶交联胶原蛋白凝胶（transglutaminase-crosslinked collagen gel, CHG）是一种经转谷氨酰胺酶（transglutaminase, TGase）交联的胶原蛋白产物，具有良好的热稳定性，在功能性食品制剂中具有潜在应用价值。然而，CHG的凝胶化是否会改变胶原源生物活性肽在胃肠道中的代谢命运及其在体内的分布，目前仍不清楚。方法：本研究考察了CHG在雄性C57BL/6J小鼠胃肠道中的滞留情况，以及血清肽水平和抗氧化活性。结果：与未水解胶原蛋白溶胶（unhydrolyzed collagen sol, CNS）和水解胶原蛋白溶胶（hydrolyzed collagen sol, CHS）相比，CHG显著延长了胃内滞留并减缓了肠道传输，胃内容物表现出更大的粒径和更为持续的蛋白质释放。CHG还提高了胃窦Cajal间质细胞（Cajal interstitial cells, ICC）相关基因（HCN1、Trpm7、CX43和c-kit）的表达，并延长了瘦素（leptin, LEP）、胆囊收缩素（cholecystokinin, CCK）、5-羟色胺（serotonin, 5-HT）和血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide, VIP）的分泌。血清肽分析显示，大多数胶原二肽和三肽的浓度在0.5至1.5 h达到峰值，随后逐渐下降；值得注意的是，在3 h时CHG组的Pro-Hyp浓度仍高于对照组，表明其在血清中出现时间延长。CHG组的血清肽（特别是Pro-Hyp）表现出总抗氧化能力（total antioxidant capacity）和羟自由基清除活性，且混合肽溶液显著减少了H₂O₂诱导的皮肤成纤维细胞中活性氧（reactive oxygen species, ROS）的积累（p < 0.001）。结论：这些研究结果表明，CHG的交联结构改变了胃肠道代谢过程，并与胶原源二肽和三肽在血清中的持续存在相关。

研究背景与意义
胶原蛋白是哺乳动物中含量丰富的结构蛋白，约占机体总蛋白的30%。口服胶原蛋白水解物可提高血清中羟脯氨酸（hydroxyproline, Hyp）二肽与三肽水平，这些肽具有抗氧化和皮肤保护等生物活性。然而，胶原蛋白水解物热稳定性差，限制了其在热加工食品中的应用；转谷氨酰胺酶（transglutaminase, TGase）交联可改善其热稳定性并形成三维凝胶网络，即转谷氨酰胺酶交联胶原蛋白凝胶（TGase-crosslinked collagen gel, CHG）。但交联凝胶如何调控胃肠道传输、特定胶原源二肽与三肽的出现时间仍不清楚；且胃肠道消化受胃窦Cajal间质细胞（Cajal interstitial cells, ICCs，胃肠起搏细胞）起搏器电位与脑-肠轴（brain-gut axis）神经内分泌网络（如LEP、CCK及5-HT、VIP）的精确调控。因此，本研究旨在揭示CHG体内消化过程与肽释放规律，为其作为新型功能性食品的开发提供进一步的体内证据。
主要技术方法
研究人员以脱脂猪肉皮为胶原来源制备CNS、CHS和CHG，以雄性C57BL/6J小鼠（每组25只，共4组）为样本队列开展研究。主要关键技术方法包括：罗丹明B荧光标记结合活体成像追踪胃肠传输；激光粒度分析测定胃内容物粒径；BCA法（bicinchoninic acid assay，二喹啉甲酸法）测定蛋白浓度；逆转录实时荧光定量PCR（reverse transcription quantitative PCR, RT-qPCR）检测胃窦ICC相关基因（HCN1、Trpm7、CX43、c-kit）；免疫组织化学检测c-kit蛋白；酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）分析血清胃肠激素与神经递质；液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）定量血清二肽与三肽；以及H₂O₂诱导皮肤成纤维细胞氧化损伤模型评价肽混合物的细胞抗氧化活性。
研究结果
3.1 胃内滞留与肠道传输：通过体内荧光成像与肠道传输率计算，CHG组在30、90和180分钟的胃内荧光强度均显著高于CNS和CHS组，呈极缓慢且持续的排空动力学，肠道传输率在三个时间点亦显著更低。结果表明，CHG的交联凝胶结构不仅产生显著的胃内滞留延长效应，还在小肠维持较慢的传输速率。
3.2 胃内容物理化性质分析：激光粒度分析显示，CHG组胃内容物平均粒径在30和90分钟显著大于CNS和CHS组；BCA测定显示，CHG组胃上清蛋白浓度在各时间点均显著最高。结果表明，CHG在胃中的崩解是连续但缓慢的过程，胃蛋白酶得以持续将不溶性胶原转化为可溶性肽并释放入上清。
3.3 胃窦相关基因与蛋白表达分析：RT-qPCR显示，CHG组在30分钟时HCN1表达即显著高于Con、CNS和CHS组，90分钟时Trpm7、CX43和c-kit表达显著上调；免疫组织化学显示，CHG组90和180分钟c-kit蛋白的组织化学评分（H-score）显著高于Con组。结果表明CHG处理与ICC相关标志物表达的改变相关。
3.4 胃肠激素与神经递质分析：ELISA显示，CHG组LEP在90和180分钟、CCK自30分钟起并在90分钟达峰值、5-HT在30、90和180分钟、VIP在30和90分钟均显著高于对照组。结果表明，CHG引起LEP、CCK、5-HT和VIP的持续升高，其时间模式与胃肠道缓慢进展动力学一致，提示脑-肠轴信号可能参与CHG的滞留效应。
3.5 血清胶原二肽与三肽的出现：LC-MS/MS定量显示，四种二肽中Pro-Hyp在各时间点浓度最高，CHG组Pro-Hyp于1.5小时达峰（2.54 μg/mL），高于CNS组（0.99 μg/mL）与CHS组（1.21 μg/mL），3小时仍维持较高浓度（1.31 μg/mL），其余二肽达峰时间亦延迟；三肽Ser-Hyp-Gly在CHG组维持较高水平。结果表明，CHG消化导致胶原源二肽与三肽在血清中更持续的出现。
3.6 吸收肽抗氧化特性分析：体外抗氧化实验显示，混合肽溶液B（×50）的总抗氧化能力与羟自由基清除率显著高于溶液A（×1）；单肽中Pro-Hyp表现最强。细胞实验显示，混合肽溶液预处理显著减少H₂O₂诱导的皮肤成纤维细胞中活性氧（reactive oxygen species, ROS）积累（p < 0.001），且呈浓度依赖性。结果表明，CHG富集的肽混合物在体外化学与细胞实验中均表现出抗氧化能力。
讨论与结论
讨论部分指出，CHG的三维共价交联网络赋予其极高机械稳定性，能抵抗胃蠕动与胃液渗透造成的碎裂，大颗粒难以通过幽门，从而延长胃滞留；凝胶溶胀有利于酸与胃蛋白酶扩散，延长的肠道传输也为酶解提供更长窗口。CHG在胃中的持续存在可对ICCs产生机械刺激，可能增强其起搏活动与电偶联，LEP、CCK、5-HT、VIP的持续升高支持脑-肠轴参与，但相关数据仅为相关性证据，确切调控通路需进一步干预研究确立。CHG的胃肠滞留与血清肽持续存在相平行，但因果关系尚未确立；TGase交联还可能改变交联位点附近构象（如Lys644、Lys738和Gln972），暴露更多切割位点，促进可吸收肽释放。抗氧化能力主要取决于Pro-Hyp浓度；由于细胞实验肽浓度高于生理血清水平且未采用体内氧化应激模型，结果应视为初步结果。
研究结论表明，CHG改变了胃肠道滞留，并与某些胶原源二肽、三肽在小鼠血清中的持续存在相关；与未水解和水解胶原蛋白溶胶相比，CHG表现出更强的胃内滞留、更慢的肠道传输、更大的胃内容物颗粒及更持续的蛋白质存在，这些效应伴随ICC相关生物标志物与脑-肠轴信号的改变；Pro-Hyp表现出最突出且最持久的血清谱；CHG特征性肽混合物及单肽（特别是Pro-Hyp）具有抗氧化活性，并可减少H₂O₂诱导的ROS积累。综上，交联胶原蛋白凝胶基质可调控胃肠道加工并延长生物活性胶原肽的系统性出现，为CHG作为潜在缓释食品配料的进一步探索提供了初步证据。