## 一、标题 **禽腺病毒血清4型ORF19A基因重组酶介导等温扩增（RAA）及CRISPR-Cas12a联合检测方法的建立与临床应用评价**

《International Journal of Molecular Sciences》：Acid-Sensing Ion Channel 1 Deficiency Aggravates Cuprizone-Induced Demyelination, Axonal Damage and Microgliosis in Mice

## 三、摘要翻译

禽腺病毒血清4型（FAdV-4）感染对全球家禽业造成严重损害。准确、及时的诊断对于有效控制FAdV-4暴发至关重要。本研究首先基于FAdV-4 NP株的ORF19A基因设计了一对特异性引物用于重组酶介导等温扩增（RAA），并对反应条件进行优化。结果显示，灵敏RAA反应的最适条件为39 °C、40 min。RAA对FAdV-4基因组的最低检测量为10^?2 ng/μL。为便于RAA结果呈现，采用侧流层析试纸条（LFD）进行可视化，RAA-LFD的最适反应时间缩短至30 min；然而其FAdV-4基因组最低可检出量为50 ng/μL，低于RAA的灵敏度。为进一步提高RAA-LFD的灵敏度，研究人员设计了LbaCas12a-FAdV-4-crRNA并将其整合入RAA，分别建立了RAA-Cas12a-F和RAA-Cas12a-LFD方法。在40 min RAA反应基础上，RAA-Cas12a-F和RAA-Cas12a-LFD仅需额外15 min；二者的最低可检出量分别为10^?6 ng/μL和10^?5 ng/μL。上述结果表明两种检测方法的灵敏度显著提高。研究人员自福建省采集了共计192份雏鸡粪便样本，并采用上述四种RAA快速检测方法进行检测。结果显示，RAA-Cas12a-F与RAA-Cas12a-LFD均筛出57份阳性样本，较RAA法多4份阳性样本，较RAA-LFD法多14份阳性样本。总体而言，研究人员建立了四种准确、快速的FAdV-4 RAA检测方法，在FAdV-4临床应用中具有可行性和一定价值。

## 四、论文解读

### 研究背景与立项依据

禽腺病毒血清4型（FAdV-4）给全球家禽业造成巨大经济损失。依据限制性内切酶消化和血清交叉中和试验，禽腺病毒（FAdV）被分为FAdV-A～E五个群及12个血清型。病毒衣壳由纤维蛋白（fiber）、五邻体（penton）和六邻体（hexon）等主要结构蛋白构成，其中fiber 1可提高细胞膜受体对野毒株的结合率并需importin α1参与入核，fiber 2影响病毒增殖过程并增强中和抗体产生。尽管FAdV-4致病机制已有较多研究，但快速、准确的检测技术对迅速控制病毒流行仍十分重要。同一病禽常可分离出多个FAdV血清型，提示不同血清型间缺乏交叉保护，且尚无商品化疫苗可预防FAdV-4感染；不同种FAdV在结构和基因组上差异显著，因此选择特异基因作为核酸检测靶序列至关重要。

重组酶介导等温扩增（RAA）是一种新型等温核酸扩增技术，依赖单链DNA结合蛋白（SSB）、UvsX重组酶和DNA聚合酶三类核心组分，通常在37～42 °C反应0.5～1 h，无需依赖昂贵仪器，适合非实验室环境和现场诊断。CRISPR-Cas系统作为多数古菌和细菌的自适应抗病毒免疫系统，可借助单链向导RNA（crRNA）特异性结合靶序列而用于核酸检测；Cas12a蛋白酶依赖其附带切割活性，通过切割非靶标标记DNA来检测体外特定DNA/RNA，结果可借助侧流层析（LFD）试纸条判读。将CRISPR-Cas12a与RAA结合，可显著提高检测的灵敏度和特异性。基于此，研究人员比较了12个不同血清型FAdV基因组，发现FAdV-4的ORF19A基因较为保守，遂以其为靶基因设计特异性引物，建立RAA、RAA-LFD、RAA-Cas12a-F和RAA-Cas12a-LFD系列检测方法，以期为养禽业提供快速、准确、易操作且灵敏的FAdV-4检测手段。

### 主要关键技术方法

研究人员自NCBI下载12个血清型FAdV-I基因组序列，经Vector NTI比对筛选出ORF19A基因（GenBank: KU991797.1）作为靶序列，用Oligo 7设计9对RAA引物并以琼脂糖凝胶电泳筛选最优引物，扩增产物克隆测序验证。以商品化RAA试剂盒建立50 μL反应体系，优化温度与时间，并与PCR比较灵敏度、特异性及重复性。在此基础上设计5′端FAM标记、内含四氢呋喃（THF）残基、3′端C3-spacer封闭的探针及5′端生物素标记下游引物，建立RAA-LFD。依据RAA扩增序列设计LbaCas12a-crRNA（PAM为5′-TTTV-3′，V为A/G/C），经PCR获取crRNA双链DNA、T7体外转录并纯化，建立RAA-Cas12a-F（Fam-TCCCT-BHQ探针）与RAA-Cas12a-LFD（Fam-TTATT-Biotin探针）。样本方面，FAdV-4 NP株、TMUV、ARV、ALV、NDV疫苗株及AIV H9等由实验室保存；20份临床肝脏样本来自疑似FAdV-4感染死亡鸡；粪便样本采自龙岩市规模化肉鸡场（n = 68）、漳州市规模化肉鸡场（n = 67）及南平市散养肉鸡（n = 57），动物实验经福建农林大学动物科学学院研究伦理委员会批准（NO: PZCASFAFU2016004）。

### 研究结果

**RAA检测FAdV-4方法的建立与初步应用。** 通过9对引物扩增产物电泳比较，第9泳道约297 bp处条带最清晰、特异性最佳且亮度最强（ImageJ定量），故选用RAA-F9/R9为最优引物，测序证实其特异性。随反应温度升高，ORF19A产物条带先变亮后变暗，37 °C与41 °C扩增效率无显著差异，故确定39 °C；随反应时间延长目标条带逐渐增亮，40 min与50 min条带清晰明亮，但50 min时目标条带上方出现微弱非特异性条带，故选择40 min。以不同浓度病毒DNA为模板，RAA可检出10^?2 copies/μL，高于PCR的最低检出浓度；以重组质粒为模板，二者最低检出均为10³ copies/μL。特异性试验中NDV、ALV、ARV、AIVH9和TMUV均阴性，仅FAdV-4阳性；批内与批间重复性良好。11份临床肝脏样本经RAA与PCR均呈阳性，两法符合率100%。

**RAA-LFD检测FAdV-4方法的建立与初步应用。** 引物探针混合物浓度为10 μM和5 μM时阴性对照T线出现假阳性，2.5 μM时阳性条带最亮且阴性结果正确，故选定2.5 μM。最优模板量为3 μL，最优反应温度39 °C，最优反应时间30 min，以T线明显显色为阳性判定标准。特异性试验中ALV、ARV、AIVH9、TMUV和NDV均阴性，FAdV-4呈明显T线阳性。RAA-LFD对FAdV-4病毒DNA最低检出限为50 ng/μL，对重组质粒最低可检出10³ copies/μL；批内、批间重复性均阳性，稳定性高。20份肝脏样本中10份阳性（阳性率50%），与RAA和PCR的阳性符合率为90.9%，表明RAA-LFD灵敏度低于RAA和PCR。

**CRISPR-Cas12a检测FAdV-4。** crRNA浓度为300 nM时Cas12a显色更明显，据此确定Cas12a荧光反应体系（20 μL）与试纸条反应体系（50 μL）；试纸条上Fam-TTATT-Biotin阳性条带最明显，故选用该探针。反应仅15 min反应管即出现明显荧光，且荧光强度随反应时间延长而增强，提示Cas12a反式切割功能被激活并持续切割荧光淬灭基团附近序列；试纸条T线在15 min即可观察，随反应时间延长C线减弱、T线增强。后续试验反应时间均为30 min。特异性结果显示除FAdV-4外其他禽病病毒均无荧光反应，试纸条法亦均阴性。RAA-Cas12a-F对FAdV-4 DNA的最低检测限为10^?6 ng/μL，对重组质粒最低检出10 copies/μL；试纸条法对病毒DNA最低检测限为10^?5 ng/μL，对质粒最低检出100 copies/μL。与RAA和RAA-LFD相比，加入Cas蛋白大幅提高了检测灵敏度。20份肝脏临床样本中11份经两法检测阳性（阳性率55%），与RAA和PCR结果一致，阳性符合率90.9%。

**RAA相关方法检测临床样本。** 龙岩和漳州规模化肉鸡场共192份粪便样本经四种方法检测均为阴性，两城市规模化鸡场临床样本阳性率为0%。南平市散养鸡57份粪便样本中，PCR与RAA均检出53份阳性，符合率100%；RAA-LFD检出43份阳性，阳性符合率81.13%；RAA-Cas12a-F与RAA-Cas12a-LFD均检出57份阳性，南平粪便样本阳性率100%，二者与PCR的阳性符合率均为92.98%，二者间符合率100%。因此以阳性率最高的RAA-Cas12a结果作为最终结果，三城市临床样本FAdV-4总阳性率为29.69%。

### 讨论与结论

讨论指出，我国禽群中流行的优势血清型为FAdV-4，可经水平和垂直传播，且不同血清型间缺乏交叉保护。与依赖约39 °C小型恒温装置的RAA相比，RAA操作要求更低，所用重组酶来源于细菌或真菌，成本低于重组酶聚合酶扩增（RPA）。LAMP引物设计复杂（需4～6条引物）、对环境要求严格且难以通过克隆测序验证产物，而RAA扩增产物可直接测序验证，RAA-LFD仅需试纸条判读，适合现场快速筛查；本研究RAA-LFD在39 °C恒温30 min内完成，较RAA缩短10 min，但其灵敏度一般，可能与商品化试纸条抗体及胶体金标记试剂浓度固定、无法针对扩增产物优化有关。RAA-Cas12a-F对病毒DNA最低检出量为10^?6 ng/μL，比RAA低10 000倍；RAA-Cas12a-LFD为10^?5 ng/μL，比RAA高1 000倍，表明所设计的FAdV-4 ORF19A-LbaCas12a-crRNA能准确结合靶序列；由于扩增靶序列上游不含TTTV位点，故选择下游5′→3′端TTTA作为原间隔序列邻近基序（PAM），证明下游PAM位点选择时LbaCas12a仍保持高效切割活性。不足之处在于RAA-Cas12a需开盖转移RAA产物，增加气溶胶污染风险；单管法虽可减少污染和时间，但灵敏度较低，可能与RAA中反应性蛋白酶与Cas相关试剂相互作用影响后期蛋白酶活性有关，尚需通过调整试剂浓度进一步研究；此外未结合免核酸提取方法延长了检测时间。临床样本中RAA与Cas12a蛋白结合检测阳性率最高，可能源于crRNA介导的指数级扩增及二次筛查后切割活性激活释放大量荧光基团，增强可视化与灵敏度。研究还发现规模化鸡场FAdV-4发生率远低于散养鸡场，表明规模化、标准化养殖实践对禽病防控至关重要，涵盖疫苗防控及养殖早期及时诊断以防止疾病传播等方面。

结论部分指出，本研究建立了四种用于FAdV-4快速准确诊断的RAA方法。其中RAA-LFD灵敏度略低，但具有可视化、便捷、快速的优势；RAA-Cas12a-F与RAA-Cas12a-LFD则表现出更高的灵敏度和特异性。总之，这些方法可能对FAdV-4的防控作出重要贡献。