《International Journal of Molecular Sciences》：Fractionation of Bioactive Polysaccharides from Volvariella volvacea and Their Ameliorative Effects on Hepatic Lipid Accumulation
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草菇（Volvariella volvacea）是一种广泛食用的食用菌，但其多糖的降脂潜力尚不明确。本研究从草菇子实体中分离出两种多糖富集组分VVP-1和VVP-2，其重均分子量分别为13,789 Da和17,829 Da。研究人员在棕榈酸（PA）刺激的AML
草菇（Volvariella volvacea）是一种广泛食用的食用菌，但其多糖的降脂潜力尚不明确。本研究从草菇子实体中分离出两种多糖富集组分VVP-1和VVP-2，其重均分子量分别为13,789 Da和17,829 Da。研究人员在棕榈酸（PA）刺激的AML12小鼠肝细胞和高脂饮食（HFD）诱导的肥胖雄性C57BL/6J小鼠中评估了它们的降脂效果。两种组分均以剂量依赖性方式降低PA诱导的细胞内甘油三酯（TG）水平，其中VVP-2显示出更强的功效趋势。在分子水平上，VVP-2处理与脂生成基因Acaca和Srebf1的下调、脂肪酸氧化相关基因Cpt1a和Ppara的上调、TNF-α、IL-6和IL-1β分泌的减少、线粒体信号的保留、线粒体膜电位的恢复以及ATP生成的增强相关。在HFD喂养的小鼠中，VVP-2（100 mg/kg）使体重增加减少38.9%，肝脏重量减少28.9%，附睾、腹股沟和肾周脂肪重量分别减少50.3%、47.5%和28.8%，改善了血清脂质谱（TG降低39.1%，总胆固醇（TC）降低33.5%，非酯化脂肪酸（NEFA）降低56.2%，低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）降低56.8%），并减轻了肝脏脂质积聚和肝损伤。这些发现表明，VVP-2可能改善线粒体功能并调节脂质代谢相关基因表达，从而潜在地减少肝细胞中的脂质积聚和炎症。这些结果支持VVP-2作为一种降脂功能性食品成分用于预防代谢功能障碍相关脂肪性肝病的潜力。
研究背景、现存问题与研究目的
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD），既往称为非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），是全球最常见的慢性肝病之一，全球患病率约38%且持续上升。MASLD主要以肝细胞中甘油三酯（TG）异常积聚为特征，可从单纯性脂肪变性进展为代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）、肝纤维化、肝硬化乃至肝细胞癌。肝脂质代谢失调是MASLD的核心驱动因素，主要表现为脂肪酸摄取增加、从头脂肪生成增强、脂肪酸β-氧化受损及极低密度脂蛋白分泌减少，最终导致肝细胞中脂质过度沉积。目前的治疗主要依赖生活方式干预和他汀类、噻唑烷二酮类等降脂药物。尽管Resmetirom和Semaglutide已获批用于治疗伴有中度至晚期纤维化的非肝硬化MASH，但源自天然产物的安全有效的降脂剂仍备受关注。
多糖广泛存在于植物、动物和微生物中，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血糖和降脂活性。越来越多的证据表明，真菌多糖在改善脂质代谢紊乱方面具有独特优势。草菇（Volvariella volvacea）是中国主要栽培的食用菌之一，年产量约33万吨，占全球产量的80%。草菇富含蛋白质、膳食纤维、维生素和矿物质，现代研究证实其具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节和抗炎活性。草菇多糖（VVPs）是其主要的活性成分之一，已被证明具有免疫调节和抗氧化活性，但其降脂作用研究甚少。因此，本研究旨在从草菇中分离并初步表征多糖组分，评估其降脂效果及潜在的分子变化，为开发草菇多糖作为降脂功能性食品成分提供依据。
主要关键技术方法
研究人员采用热水提取和乙醇沉淀法获得粗多糖，经三氯乙酸（TCA）脱蛋白后，依次通过DEAE-52纤维素柱层析和Sephadex G-100凝胶柱层析进行分级纯化，得到两个多糖富集组分VVP-1和VVP-2。利用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定分子量。体外实验采用棕榈酸（PA）刺激的AML12小鼠肝细胞模型，体内实验采用高脂饮食（HFD）诱导的肥胖C57BL/6J小鼠模型（每组6只，共6组），辛伐他汀（SIM）作为阳性对照。通过CCK-8法检测细胞活力，生化试剂盒测定TG、总胆固醇（TC）、非酯化脂肪酸（NEFA）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），RT-qPCR检测脂质代谢相关基因mRNA水平，转录组测序（RNA-seq）分析差异表达基因（DEGs），ELISA检测炎症因子，荧光染色评估线粒体功能，油红O染色和H&E染色观察组织病理学变化。
研究结果
2.1 多糖得率与蛋白含量
从500 g干燥草菇中获得约45 g粗多糖，提取率约为9%。TCA脱蛋白将蛋白含量从21.0%显著降至2.5%，蛋白去除率约88.1%，多糖保留率为92.5% ± 1.5%。
2.2 粗多糖的分级
DEAE-52纤维素柱层析显示，大部分多糖集中在水洗脱峰和0.1 mol/L NaCl洗脱峰中。这两个主要组分经Sephadex G-100进一步纯化后，水洗脱组分得到一个单一对称峰，命名为VVP-1；0.1 mol/L NaCl洗脱组分得到一个主要对称峰，命名为VVP-2。化学组成分析表明，VVP-1含95.32% ± 2.31%总糖、3.72% ± 0.043%糖醛酸和0.11% ± 0.002%残留蛋白；VVP-2含95.66% ± 2.02%总糖、4.03% ± 0.038%糖醛酸和0.10% ± 0.004%残留蛋白。两种组分内毒素水平均低于0.01 EU/mg。
2.3 分子量测定
HPGPC测定结果显示，VVP-1的主峰（占总峰面积85%以上）保留时间为36.028 min，重均分子量（Mw）为13,789 Da，数均分子量（Mn）为7,528 Da，多分散系数（Mw/Mn）为1.83。VVP-2的主峰（占总峰面积95%以上）保留时间为35.357 min，Mw为17,829 Da，Mn为7,542 Da，Mw/Mn为2.36。
2.4 VVP-2对PA刺激的AML12细胞脂质含量和炎症因子表达的影响
CCK-8实验表明，VVP-1和VVP-2在0-100 μg/mL范围内以剂量依赖性方式提高细胞活力，100 μg/mL时活力最高。TG测定和油红O染色显示，两种多糖均以剂量依赖性方式降低PA诱导的TG升高和脂滴积聚，VVP-2效果优于VVP-1。预处理和洗脱实验表明，VVP-2的效应并非仅依赖于共孵育期间对PA摄取的即时抑制，还可能涉及更持久的细胞内改变。
2.5 VVP-2对PA刺激的AML12细胞转录组的影响
转录组测序分析显示，主成分分析（PCA）表明对照组、模型组和VVP-2处理组间明显分离。与对照组相比，PA暴露产生197个上调基因和53个下调基因。与模型组相比，VVP-2共孵育产生511个上调基因和770个下调基因。GO和KEGG富集分析表明，PA改变的基因主要富集于能量代谢、氧化磷酸化和脂质代谢通路；VVP-2处理后，DEGs集中于脂肪酸代谢、脂肪酸降解、线粒体氧化磷酸化和炎症相关通路。共有36个基因被VVP-2部分逆转，多数与代谢调控和炎症/免疫反应相关。
2.6 VVP-2对脂质代谢相关基因表达的影响
RT-qPCR结果表明，与对照组相比，模型组中脂生成基因Acaca（乙酰辅酶A羧化酶）和Srebf1（固醇调节元件结合蛋白1）显著上调，而脂肪酸氧化基因Cpt1a（肉碱棕榈酰转移酶1a）和Ppara（过氧化物酶体增殖物激活受体α）显著下调。VVP-2共孵育以剂量依赖性方式显著逆转了这些变化。
2.7 VVP-2对AML12细胞线粒体功能的影响
Mito-Tracker Green染色显示，模型组绿色荧光强度较对照组明显减弱，VVP-2处理后荧光强度有所恢复。模型组细胞内ATP含量显著降低，线粒体膜电位显著下降。VVP-2以剂量依赖性方式显著提高了ATP含量并恢复了线粒体膜电位，高剂量组接近对照组水平。
2.8 VVP-2对AML12细胞炎症反应的影响
ELISA检测结果显示，模型组细胞培养上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均显著高于对照组。VVP-2以剂量依赖性方式降低了这三种炎症因子的水平，100 μg/mL时抑制作用最强。
2.9 VVP-2对HFD诱导肥胖小鼠全身代谢的影响
在为期八周的实验中，HFD组小鼠体重进行性增加，VVP-2从第4周开始显著抑制体重增加。各组间食物摄入无显著差异。VVP-2和SIM均有效降低了肝脏、附睾、腹股沟和肾周脂肪组织的重量。
2.10 VVP-2对HFD诱导肥胖小鼠肝脏脂质积聚和肝损伤的影响
与普食组相比，HFD组血清TG、TC、NEFA和LDL-C水平显著升高，肝脏出现严重脂质沉积，血清ALT和AST水平显著升高，H&E染色显示明显的肝细胞气球样变和炎症浸润。VVP-2和SIM均显著降低了上述血清脂质指标、ALT和AST水平，减轻了肝脏脂质沉积和病理学改变，并降低了MASLD活动度评分（MAS）。
讨论与结论
讨论部分指出，本研究成功从草菇子实体中分离出两种多糖富集组分VVP-1和VVP-2，其Mw分别为13,789 Da和17,829 Da，属于低至中等分子量范围。体外实验表明，VVP-2以剂量依赖性方式降低PA刺激的AML12肝细胞中TG和脂滴积聚，其效应可能与协调调控脂质合成和脂肪酸氧化相关基因表达、减轻炎症以及改善线粒体功能有关。VVP-2相较于VVP-1表现出更强的活性趋势，研究人员推测这可能与两者结构或理化性质的差异有关，但本研究未确定这些结构特征。转录组测序分析为这种调控模式提供了全局支持。然而，讨论部分也指出了研究的局限性：所提出的机制仅为相关性，未测定蛋白水平、脂肪酸氧化通量或进行抑制剂实验；VVP-1和VVP-2应被视为多糖富集组分而非完全纯化的多糖，其构效关系有待建立；此外，未考察对肠道菌群的影响。
研究结论部分翻译如下：从草菇中分离并分级得到两种多糖富集组分VVP-1和VVP-2。VVP-2在对抗PA诱导的肝细胞脂质积聚方面表现出更强的活性趋势。转录组测序提示，其降脂作用可能与调节脂肪酸代谢、线粒体氧化磷酸化和炎症相关通路有关。VVP-2处理与脂生成基因Acaca和Srebf1的下调、脂肪酸氧化基因Cpt1a和Ppara的上调、TNF-α、IL-6和IL-1β分泌的减少、线粒体信号的保留、线粒体膜电位的恢复以及ATP生成的增强相关。这些协同变化伴随着高脂应激下肝细胞脂质代谢功能障碍的改善。在小鼠中，VVP-2还减轻了HFD诱导的体重增加，降低了肝脏和脂肪组织重量，改善了血清脂质谱，并减轻了肝脏脂质沉积和肝损伤。这些发现为开发草菇多糖作为降脂功能性食品成分提供了初步的实验支持。
