《International Journal of Molecular Sciences》：Protopanaxatriol Inhibits Listeria monocytogenes Infection Through a Multi-Target Virulence Suppression Strategy
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单核细胞增生李斯特菌（*Listeria monocytogenes*，LM）感染依赖于多种毒力因子的协同作用，包括但不限于鞭毛介导的细菌运动、李斯特菌溶血素O（listeriolysin O，LLO）介导的免疫逃逸与炎症反应、由分选酶A（SortaseA，S
单核细胞增生李斯特菌（*Listeria monocytogenes*，LM）感染依赖于多种毒力因子的协同作用，包括但不限于鞭毛介导的细菌运动、李斯特菌溶血素O（listeriolysin O，LLO）介导的免疫逃逸与炎症反应、由分选酶A（SortaseA，SrtA）锚定于细胞壁的多种毒力蛋白，以及内化素（internalin）介导的黏附与侵袭。上述毒力因子是开发抗LM感染抑制剂的潜在关键靶点。研究发现，人参三醇（protopanaxatriol，ptt）可显著抑制LM对上皮细胞的黏附与侵袭，其机制可能在于干扰内化素A/内化素B（InlA/InlB）介导的宿主细胞互作并降低*inlA*与*inlB*的转录水平。InlA经SrtA锚定于细胞壁，计算机模拟分析预测ptt可与SrtA的关键活性残基相互作用。此外，预测ptt可与LLO相互作用并抑制其寡聚体形成，导致其成孔活性丧失。鞭毛、SrtA与LLO均影响细菌生物被膜形成；ptt在不影响LM生长的前提下抑制生物被膜形成并破坏成熟生物被膜。最后，ptt通过提高存活率与减轻组织损伤对大蜡螟（*Galleria mellonella*）发挥抗LLO与抗LM的保护作用。上述结果表明，ptt在LM感染的预防与控制方面具有良好潜力。
**研究背景与立题依据**
单核细胞增生李斯特菌（*Listeria monocytogenes*，LM）是一种广泛分布于自然界的食源性病原菌和人兽共患病病原，可在低温条件下存活，食用未充分加热的食物存在感染风险。其临床主要表现为菌血症、脑膜炎、细菌性腹膜炎、自发性流产及胎儿死亡。作为胞内菌，LM主要侵害免疫功能低下人群（如老年人、新生儿），而抗生素的不规范使用已导致临床治疗中出现耐药，故研发抗LM药物十分迫切。在动物中，LM主要经粪口途径感染畜禽，临床症状与人类相似；因其"低发病率、高死亡率"的流行病学特征，多国将其列为食品安全监测的重点对象。因此，开发天然抗LM感染抑制剂对食品安全、畜禽养殖及人类健康均有重要意义。
LM在细胞侵袭及后续毒性过程中，LLO作为最关键毒力因子发挥核心作用。LLO是由*hly*基因编码的胆固醇依赖性溶细胞素（cholesterol-dependent cytolysin，CDC），在感染吞噬细胞时特异性识别吞噬体膜上的胆固醇并寡聚化形成前孔复合物，继由构象变化驱动寡聚体插入膜内形成孔道，使细菌逃逸至胞质。LLO还显著调控LM生物被膜形成，*hly*基因缺失会严重削弱生物被膜形成并降低致病性，故LLO是抗LM抑制剂开发的重要靶点；已有研究证实根皮素、木犀草素、桑色素和山奈酚等天然产物通过靶向LLO活性对抗LM感染。内化素是LM侵入非吞噬细胞的"分子钥匙"，其中InlA经SrtA识别其LPXTG基序而共价锚定于细胞壁，进而靶向宿主E-钙黏蛋白（E-cadherin）介导细菌黏附；InlB则识别并激活受体酪氨酸激酶Met（c-Met），通过非共价作用锚定于细胞壁，促进LM侵入宿主细胞，二者均被视为潜在治疗靶点。为加速此类毒力靶点抑制剂的发现，近年基于结构的计算手段，尤其是分子对接结合分子动力学（molecular dynamics，MD）模拟，已广泛应用于抗菌药物发现，并成功用于鉴定LM毒力调控因子的新型抑制剂。人参三醇（protopanaxatriol，ptt）是从人参中提取的天然活性化合物，已报道可有效治疗阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）相关认知衰退、减轻心肌肥厚并抑制结肠癌进展。鉴于天然产物是抗细菌感染药物的重要来源，且前期筛选显示ptt具有良好治疗效果，本研究深入探究其治疗机制。
**主要关键技术方法**
研究以LM标准株BAA-679（即EGD-e，购自ATCC）和HeLa细胞为材料，开展黏附与侵袭试验及SrtA活性抑制试验；采用AutoDock Vina 1.2.7进行分子对接，GROMACS 2020.6进行MD模拟并以MMPBSA计算结合自由能；通过RT-qPCR检测毒力基因转录；以溶血试验和Western blotting分析LLO功能与分泌；用结晶紫染色评价生物被膜；经透射电镜观察鞭毛；并建立大蜡螟（*Galleria mellonella*）LLO毒性与LM感染模型进行体内评价。
**研究结果**
**2.1.1 结果分析**：ptt化学结构见原文，16与32 μg/mL ptt使LM对HeLa细胞的黏附率降至约57%和32%，侵袭率降至约50%和35%。对接预测ptt可结合InlA/InlB与宿主受体的互作界面，作用残基包括Trp387、Tyr347、Gln409及Phe104、Phe105、Phe127；qPCR显示ptt处理后*inlA*与*inlB*相对表达量显著下调。结论：ptt抑制LM黏附与侵袭，可能与降低*inlA*/*inlB*转录及干扰其与宿主受体界面有关。
**2.1.2 ptt通过关键活性残基互作抑制SrtA活性**：ptt对SrtA活性呈显著剂量依赖性抑制，16至64 μg/mL抑制率逐渐升高；对接预测ptt占据SrtA活性口袋并与催化残基His127、Arg197、Cys188作用。MD模拟显示复合物RMSD在40 ns后稳定于约0.6 nm，ptt与SrtA距离始终低于0.4 nm且全程未脱离口袋；能量分解表明Leu104、Met111、Ile186对总结合自由能贡献较大，Thr187、His128、Cys188提供较多静电作用，Arg197、Met111、His127、Cys188贡献较多范德华作用。因LM SrtA与金黄色葡萄球菌SrtA（Sa-SrtA）高度同源，将预测复合物与Sa-SrtA–LPETG共晶结构比对，发现ptt结合位置与LPETG结合位点重叠。结论：ptt可能占据底物结合口袋、阻碍LPXTG基序底物识别，从而抑制SrtA功能。
**2.1.3 ptt有效抑制LLO及LM培养上清的溶血活性**：纯化LLO与不同浓度ptt共孵后血红蛋白释放率为94.10%、87.00%、81.53%和61.03%；ptt处理减少LLO寡聚体形成，对接预测ptt在LLO上有三种结合模式（采用盲对接，除结构域3/4交界外还发现其他位点）。ptt预处理LM培养上清后溶血活性依次为92.99%、85.77%、81.92%和74.52%；而与ptt共培养的LM上清溶血率由90.63%降至63.81%（16 μg/mL）和15.90%（32 μg/mL），且上清中LLO分泌量减少。以已报道抑制剂amentoflavone与atractylodin验证对接方案可靠性。结论：ptt干扰LLO寡聚化使其功能丧失，并通过减少LLO分泌使培养物溶血活性失活。
**2.1.4 ptt经调控鞭毛基因fliY、fliM、flhB抑制LM泳动能力**：未处理组呈明显同心圆泳动，32 μg/mL ptt组同心圆形态被破坏；ptt处理后细菌鞭毛极少见；*fliY*、*fliM*、*flhB*相对表达量分别降至约0.13、0.39和0.23。结论：ptt通过下调鞭毛基因转录影响鞭毛形成，从而削弱LM运动能力。
**2.1.5 ptt破坏LM成熟生物被膜并抑制其形成而不抑制细菌生长**：结晶紫染色显示ptt处理组生物被膜残留率在32、64、128 μg/mL下分别降至62.59%、39.91%和33.80%；生物被膜形成率降至58.60%、55.55%和约48.36%；被膜内活菌数无显著变化；ptt对LM的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）大于1024 μg/mL，各浓度生长曲线几乎一致。结论：ptt在不杀菌的前提下抑制被膜形成并破坏成熟被膜。
**2.1.6 ptt在体内保护大蜡螟免受LLO毒性**：LLO注射组24 h存活率仅30.00%，32 h降至16.67%，48 h为13.33%；ptt处理组24 h达83.33%，32 h维持73.33%，48 h为46.67%。表型上LLO感染引起幼虫明显肿胀与变黑，ptt减轻黑化程度；组织病理显示LLO组组织结构破坏严重，ptt处理后明显改善。结论：ptt可有效拮抗LLO毒性并提高大蜡螟存活率。
**2.1.7 ptt对LM攻击的大蜡螟发挥保护作用**：空白组96 h内100%存活，感染组12 h起出现死亡、96 h无存活个体，ptt治疗组最终存活率为33.66%；感染组虫体肿胀并充满黑色素，ptt组症状显著缓解；LM感染造成严重组织坏死，ptt减轻该损伤。结论：ptt通过提高存活率与缓解组织损伤降低LM体内致病性。
**讨论部分与结论**
讨论指出，LM感染临床治疗主要依赖抗生素，但低剂量对胞内菌效果有限、高剂量易诱导耐药，故靶向毒力因子而非直接杀菌是重要研究策略。黏附与侵袭是胞内感染的起始事件，现有InlA/InlB抑制剂多为单靶点且机制认识不足，且研究多集中于阻断毒力因子与宿主受体互作，针对毒力决定子表达调控的策略有限；本研究显示ptt显著减弱LM黏附与侵袭，*inlA*/*inlB*表达下降及对接预测的界面干扰可解释这一效应。SrtA可将十余种含LPXTG基序毒力蛋白锚定于细胞壁，LLO则助细菌逃逸吞噬体杀伤，鞭毛运动利于趋向靶组织与定植；研究证实ptt预测与SrtA关键活性残基互作、减少SrtA依赖毒力蛋白的壁锚定，抑制LLO寡聚化与分泌从而降低溶血活性，并经下调鞭毛基因削弱泳动。鉴于LLO、SrtA与鞭毛均与生物被膜形成密切相关，ptt对成熟被膜的破坏提示其有缓解持续性感染的潜力；体内模型进一步证明其系统性保护作用。作者认为，现有LM毒力抑制剂多为单靶点或双靶点，而ptt具多靶点特征，是开发新型抗LM策略的有前景候选物；后续仍需以表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）、等温滴定量热（isothermal titration calorimetry，ITC）或共结晶验证靶蛋白互作，并在哺乳动物模型中确认保护作用、阐明体内代谢与生物利用度。
研究结论（译文浓缩）：ptt为从人参中提取的天然化合物，本身不具直接杀菌活性，而是通过多靶点抗毒力机制降低LM致病性——显著减少LM对上皮细胞的黏附与侵袭（可能经干扰InlA/InlB与宿主受体互作及抑制*inlA*/*inlB*转录）；预测与SrtA互作并损害其生物学功能，减少SrtA依赖毒力蛋白的细胞壁锚定；抑制LLO寡聚化并减少其分泌，减弱纯化LLO及LM培养上清的溶血活性，可能有助于阻止LM逃避宿主免疫清除；通过下调关键鞭毛基因抑制鞭毛形成、损害运动能力；不影响细菌生长但显著抑制生物被膜形成并破坏成熟被膜；在大蜡螟感染模型中对LLO与LM所致毒性提供系统性保护。综上，ptt是开发新型抗LM感染策略的有前景先导化合物。
