跨队列单细胞转录组解析特发性肺纤维化（IPF）翻译/RNA结合蛋白（RBP）相关成纤维细胞状态并指导药物重定位

《International Journal of Molecular Sciences》：Single-Cell Transcriptomic Analysis Identifies a Translation/RBP-Related Fibroblast Signature for Drug Repurposing in Idiopathic Pulmonary Fibrosis

特发性肺纤维化（IPF）以成纤维细胞持续活化和细胞外基质（ECM）过度沉积为特征。然而，IPF成纤维细胞内与翻译及RNA结合蛋白（RBP）相关过程有关的转录异质性仍未得到充分表征。在此，研究人员分析了两个独立的人IPF单细胞RNA测序队列，以识别在Translation/RBP相关转录程序上存在差异但共享高纤维化输出的成纤维细胞状态。在GSE136831中进行供体配对伪批量（pseudobulk）分析，识别出区分这些状态的转录特征；并在独立GSE135893队列中保留显示一致方向变化的基因，以推导跨队列特征。随后，研究人员利用CLUE、L1000CDS2和iLINCS的反向连接分析（reverse-connectivity analysis），优先筛选预测可在转录水平对抗该特征的化合物。候选化合物随后在转化生长因子-β₁（TGF-β₁）刺激的人胎肺成纤维细胞（HFL-1）中评估，并以细胞活力、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和I型胶原（collagen I）用于初步表型评价。PP-1、PK-11195、dabrafenib、GSK-1059615和dasatinib在测试浓度范围内降低两种促纤维化标志物，被确定为值得进一步研究的候选物。总之，这些发现定义了IPF中跨队列的Translation/RBP相关成纤维细胞特征，并支持其作为转录组指导策略用于优先筛选具有抗纤维化表型活性的化合物。

研究背景：IPF（idiopathic pulmonary fibrosis，特发性肺纤维化）是进行性致死性间质性肺病，特征为肺泡结构破坏和ECM（extracellular matrix，细胞外基质）过度沉积；成纤维细胞和肌成纤维细胞持续活化，产生胶原、纤连蛋白等基质成分，导致组织重塑和肺功能下降。现有抗纤维化治疗包括吡非尼酮、尼达尼布及PDE4B（phosphodiesterase 4B，磷酸二酯酶4B）抑制剂nerandomilast，可减缓肺功能下降，但IPF仍呈进行性，需进一步抑制活化成纤维细胞持续纤维化输出。活化成纤维细胞通过持续产生ECM和促纤维化蛋白发挥作用，mRNA稳定性和翻译控制等转录后机制塑造蛋白输出；翻译控制可调节胶原合成和肌成纤维细胞分化，RBP（RNA-binding protein，RNA结合蛋白）如HuR和DDX3参与成纤维细胞活化和肺纤维化。然而，Translation/RBP相关过程是否共同定义人IPF成纤维细胞疾病相关分子程序仍不清楚。单细胞转录组研究揭示IPF肺成纤维细胞异质性，并可在定义细胞群层面检查疾病相关程序；转录组连接分析可识别扰动谱与疾病相关表达特征相反的化合物。研究人员因此整合两个独立人IPF单细胞RNA测序队列，识别Translation/RBP相关成纤维细胞转录特征，并用反向连接分析优先候选化合物，在TGF-β₁（transforming growth factor-β₁，转化生长因子-β₁）诱导HFL-1（human fetal lung fibroblast，人胎肺成纤维细胞）活化模型中进行评价。该研究建立状态指导策略，将Translation/RBP相关成纤维细胞特征与IPF药物重定位及抗纤维化筛选连接起来。

主要方法：使用GEO来源的GSE136831为发现队列、GSE135893为独立方向评估队列；以Seurat（v5.4.0）处理单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据、UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection，统一流形近似与投影）降维聚类并鉴定成纤维细胞；按供体特异阈值，将纤维化输出评分≥70百分位且Translation/RBP程序评分≥70或≤30百分位者定义为fibrosis-high/Translation/RBP-high与low状态；供体配对伪批量edgeR差异表达，构建UP84/DOWN84发现特征，并在GSE135893以至少50%配对供体方向一致保留UP56/DOWN35跨队列特征；用CLUE、L1000CDS2、iLINCS反向连接分析及共识排序；在TGF-β₁刺激HFL-1中，以CCK-8（Cell Counting Kit-8，细胞计数试剂盒-8）、Live/Dead、免疫荧光和Western blot评估活力及α-SMA（α-smooth muscle actin，α-平滑肌肌动蛋白）、collagen I表达。

研究结果：
2.1 单细胞分析识别Translation/RBP相关转录状态及IPF中的转录特征（Single-Cell Analysis Identifies Translation/RBP-Related Transcriptional States and a Transcriptional Signature in IPF）。GSE136831中成纤维细胞 compartment 含5672个细胞，其中4566个来自IPF肺，分布于多个转录状态；按供体内纤维化输出评分≥70百分位及Translation/RBP评分≥70或≤30百分位定义两状态，15名供体可配对；配对伪批量edgeR分析得758个差异表达基因（DEG），包括489个上调和269个下调（FDR＜0.05，|log₂FC|≥0.5）；过滤后因候选集偏向上调，构建UP84/DOWN84发现特征，代表基因在多数配对供体方向一致。结论：IPF成纤维细胞存在Translation/RBP相关转录状态，并获得供体一致的发现特征。

2.2 独立方向评估支持跨队列Translation/RBP相关特征（Independent Directional Assessment Supports the Cross-Cohort Translation/RBP-Related Signature）。GSE135893中2653个成纤维细胞（2311个来自IPF肺）用同一框架恢复两状态，10名供体可配对；158个可评估特征基因中，在至少50%配对供体保持发现方向者被保留，得到UP56/DOWN35、共91个基因的跨队列特征；GenCLiP3文本挖掘和PubMed审查显示84.6%特征基因与IPF、肺纤维化或成纤维细胞/肌成纤维细胞生物学相关，15.4%研究较少；STRING网络显示许多基因直接注释于IPF或嵌入网络，CSF1、NFKBIA、RHOA、NPM1、HSPA8等高度连接。结论：独立队列支持该特征，且其特征基因位于IPF及成纤维细胞相关生物背景。

2.3 多平台连接分析优先候选化合物（Multi-Platform Connectivity Analysis Prioritizes Candidate Compounds）。以UP56/DOWN35特征查询CLUE、L1000CDS2和iLINCS，整合平台结果形成共识排序，并结合化合物可追溯性、试剂可得性和实验可行性定义20化合物面板；丙戊酸（valproic acid）和伏立诺他（vorinostat）被优先且已有肺纤维化抗纤维化证据，作为文献支持参考化合物。结论：多平台反向连接分析可优先候选化合物，参考化合物的回收支持该特征筛选的疾病相关性。

2.4 候选化合物细胞活力评估（Cell Viability Assessment of Candidate Compounds）。除参考化合物外，其余18个候选物用CCK-8在预设浓度范围评估HFL-1活力，表1总结测试范围、平均活力保持≥85%的最高浓度、对应活力值及后续表型评价浓度；Live/Dead染色和相差成像进一步评估耐受性；geldanamycin和NVP-AUY922在0.025 μM时平均活力分别91.6±7.2%和92.2±2.5%，但形态改变明显，未进入后续抗纤维化表型筛选；其余候选物综合选择后续浓度。结论：确定各候选物用于后续表型评价的浓度。

2.5 候选化合物表型筛选及浓度反应评价（Phenotypic Screening and Concentration-Response Evaluation of Candidate Compounds）。在TGF-β₁刺激HFL-1中，TGF-β₁显著增加α-SMA和collagen I，SB-431542明显降低两者，确认 assay 反应性；丙戊酸和伏立诺他也降低两标志物；PP-1、PK-11195、dabrafenib、GSK-1059615和dasatinib一致降低α-SMA和collagen I并进入浓度反应评价，其他化合物作用较弱或对单一标志物更明显。免疫荧光和Western blot显示五化合物在效应出现浓度及对两标志物相对作用上不同：PP-1和PK-11195低浓度作用有限、较高浓度增强；dabrafenib呈非单调反应，40–80 μM较强；GSK-1059615在测试范围上端抑制更强；dasatinib持续抑制α-SMA，而collagen I抑制主要见于较高浓度。结论：五个候选物均能降低促纤维化表型，但浓度反应模式不同。

讨论总结：该研究将Translation/RBP相关成纤维细胞状态与跨队列91基因特征连接，并用于反向连接分析和TGF-β₁-HFL-1表型评价。α-SMA和collagen I未纳入用于化合物优先筛选的转录特征，因此其降低提供独立实验证据，表明由该特征识别的化合物可调节成纤维细胞活化和胶原产生；这些效应是否伴随Translation/RBP相关转录状态逆转尚待确定。该特征还可用于单细胞和空间转录组数据以分析状态在患者中的分布及与特定成纤维细胞群、纤维化病变或组织生态位的关系，也可评估化合物处理后的分子响应，并与调控网络分析结合识别上游调控因子。药物机制方面，PP-1和dasatinib靶Src家族激酶信号，既往Src抑制可抑制TGF-β₁诱导的肌成纤维细胞分化和ECM产生；GSK-1059615为PI3K/mTOR双抑制剂，PI3K/mTOR异常与IPF相关；dabrafenib虽有IPF药物重定位及纤维化模型证据，但本实验呈非单调反应，且有效浓度高于既往细胞研究和标准临床剂量150 mg每日两次报道的系统血浆浓度；PK-11195为高亲和TSPO配体，本实验最强效应在80 μM，微摩尔浓度可能存在非TSPO介导效应。局限包括：Translation/RBP程序由转录组推断，不直接测量翻译活性、RNA稳定性或单个RBP活性；两状态用供体特异评分阈值操作定义，应视为对比表达状态而非离散成纤维细胞亚型；查询的扰动签名来自多样细胞背景，可能限制直接迁移至IPF成纤维细胞；药理实验使用TGF-β₁刺激HFL-1，不能完全代表原代IPF成纤维细胞的供体特异和疾病相关特性；尚需患者来源原代肺成纤维细胞、机制探究和体内研究验证。

研究结论（翻译）：本研究识别人IPF肺成纤维细胞中Translation/RBP相关转录状态，并基于其表达差异推导跨队列特征。该特征在多平台反向连接分析中优先出预测具有相反转录效应的化合物，其中若干随后降低TGF-β₁诱导的HFL-1细胞α-SMA和collagen I表达。这些发现支持利用成纤维细胞状态来源的转录特征优先筛选可实验测试的IPF药物重定位候选物。