《International Journal of Molecular Sciences》：Oral 25-Hydroxycholesterol Suppresses 4T1 Tumour Growth in an Immune-Context-Associated Manner
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三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer, TNBC）是一种具有侵袭性且靶向治疗选择有限的亚型。25-羟基胆固醇（25-hydroxycholesterol, 25-HC）是一种参与代谢与免疫调节的氧化固醇（oxysterol）
三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer, TNBC）是一种具有侵袭性且靶向治疗选择有限的亚型。25-羟基胆固醇（25-hydroxycholesterol, 25-HC）是一种参与代谢与免疫调节的氧化固醇（oxysterol），但其抗肿瘤效应仍具有情境依赖性。研究人员考察了口服25-HC是否抑制免疫活性BALB/c小鼠的4T1肿瘤生长，以及宿主免疫状态是否改变该反应。携带4T1肿瘤的小鼠接受口服溶媒或25-HC（1或10 mg/kg）每日一次，持续14天（每组n = 6）。25-HC使终点肿瘤体积从1510.6 ± 235.4 mm3（溶媒）降至1147.2 ± 243.1和866.7 ± 206.6 mm3（校正后p = 0.027和0.0004）；10 mg/kg剂量还降低了肿瘤重量和Ki-67阳性率，增加了CD8阳性T细胞浸润及颗粒酶B（granzyme B, GZMB）阳性比例，减少了M2样巨噬细胞并提高了M1/M2比值。肿瘤组织中的腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK）信号发生改变，p-AMPK/AMPK增至对照组的1.23倍和1.57倍，而p-STAT6/STAT6降至0.81倍和0.46倍。血清25-HC随剂量升高，而瘤内25-HC在10 mg/kg时最低；在BALB/c裸鼠中未观察到剂量相关的降低。因此，口服25-HC以具有免疫环境相关特征的方式抑制了4T1肿瘤生长；然而，治疗与宿主的交互作用未达到统计学显著性（p = 0.06），且反应的免疫环境相关性仍属提示性而非确定性。这种血清-肿瘤的反向模式是一种单时间点的描述性观察，其成因不明，从而提出了关于免疫细胞相关25-HC处理的、可检验的假说。
三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer, TNBC）是一类缺乏雌激素受体（estrogen receptor, ER）、孕激素受体（progesterone receptor, PR）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）表达的侵袭性乳腺癌亚型，具有进展迅速、早期复发及内脏转移倾向，化疗仍是其主要全身治疗手段。尽管免疫检查点抑制剂和抗体-药物偶联物已扩展了治疗格局，但耐药性与肿瘤异质性仍是亟待突破的瓶颈。胆固醇及其氧化衍生物在膜组织、细胞信号转导及免疫调节中发挥重要作用，其中25-羟基胆固醇（25-hydroxycholesterol, 25-HC）的效应呈现强烈情境依赖性：在肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）中，25-HC溶酶体蓄积可激活AMPKα与信号转导及转录激活因子6（signal transducer and activator of transcription 6, STAT6），驱动免疫抑制性转录程序；另一方面，25-HC亦可作为细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes, CTLs）的代谢燃料被消耗，影响其效应功能与存活。由此，25-HC的局部浓度由巨噬细胞产生与活化T细胞消耗之间的动态平衡所决定，这一平衡可能是其抗肿瘤或促肿瘤双重作用的机制基础。4T1同基因小鼠模型作为免疫活性的TNBC模型，能够同步评估肿瘤生长与宿主免疫应答。基于上述背景，研究人员提出假设：外源性25-HC可通过协调肿瘤代谢与免疫微环境抑制TNBC进展，且该效应可能受宿主免疫状态调控。
研究人员利用免疫活性BALB/c小鼠及T细胞缺陷BALB/c裸鼠构建4T1皮下移植瘤模型，通过口服灌胃给予溶媒或25-HC（1 mg/kg与10 mg/kg）连续14天，系统评估肿瘤生长动力学、免疫微环境重塑及胆固醇代谢信号变化。研究得出核心结论：口服25-HC可在免疫活性小鼠中显著抑制4T1肿瘤生长，伴随肿瘤细胞增殖降低、细胞毒性CD8阳性T细胞特征增强、M2样巨噬细胞优势减弱及肿瘤AMPK/STAT6信号重塑；但在裸鼠中抗肿瘤反应明显减弱，尽管高剂量组Ki-67阳性率仍出现中间程度下降。治疗与宿主背景的交互作用未达统计学显著（p = 0.06），提示该效应可能由直接抗增殖成分与免疫环境相关成分共同构成。这些发现支持25-HC作为TNBC前临床免疫代谢候选药物的进一步评估价值。
为开展此项研究，研究人员采用了以下关键技术方法：通过皮下接种2 × 10
6个4T1细胞建立免疫活性BALB/c小鼠及BALB/c裸鼠移植瘤模型，采用随机分组后口服灌胃给予不同剂量25-HC；运用免疫组织化学染色检测Ki-67增殖指数；通过多重免疫荧光双标（CD8/颗粒酶B（granzyme B, GZMB）、CD68/诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）、CD68/甘露糖受体C型1（mannose receptor C-type 1, CD206））定量分析T细胞浸润及巨噬细胞极化；采用蛋白质免疫印迹（Western blotting）检测肿瘤组织中磷酸化AMPK（p-AMPK）与磷酸化STAT6（p-STAT6）的蛋白表达；利用竞争性酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）结合改良Bligh-Dyer法提取测定血清及瘤内25-HC浓度；并运用单因素及双因素方差分析（ANOVA）进行统计学处理。样本队列来源于6周龄雌性BALB/c小鼠及BALB/c裸鼠（南京泽元生物科技有限公司），4T1细胞购自中国科学院细胞库。
2.1. 25-HC在免疫活性4T1荷瘤小鼠中降低肿瘤负荷
研究人员通过测量肿瘤生长曲线与终点体积发现，口服25-HC使免疫活性BALB/c小鼠的终点肿瘤体积从溶媒组的1510.6 ± 235.4 mm
3降至1 mg/kg组的1147.2 ± 243.1 mm
3与10 mg/kg组的866.7 ± 206.6 mm
3，校正后p值分别为0.027与0.0004；肿瘤重量亦呈同向显著降低，表明25-HC可有效减轻免疫活性宿主的肿瘤负荷。
2.2. 口服25-HC升高血清水平但降低瘤内水平
借助ELISA检测，研究人员发现血清25-HC水平随剂量依赖性升高，而瘤内25-HC（标准化为总蛋白）在10 mg/kg组降至最低（12.92 ± 1.73 μg/mg蛋白），显著低于溶媒组（28.97 ± 4.43 μg/mg蛋白）与1 mg/kg组，呈现反向的血清-肿瘤分布格局。
2.3. 25-HC降低肿瘤细胞增殖
Ki-67免疫染色结果显示，10 mg/kg组Ki-67阳性率较溶媒组显著降低（校正后p = 0.0013），1 mg/kg组呈降低趋势但未达统计学显著（p = 0.059），提示25-HC对4T1细胞增殖具有剂量依赖性抑制效应。
2.4. 25-HC增强细胞毒性CD8阳性T细胞特征
CD8/GZMB共免疫荧光分析表明，25-HC处理增加了肿瘤内CD8阳性T细胞比例，且10 mg/kg组CD8阳性细胞中GZMB阳性分数显著升高（校正后p = 0.0403），提示细胞毒性效应特征获得增强。
2.5. 25-HC使肿瘤巨噬细胞偏离M2主导状态
通过CD68/iNOS与CD68/CD206双标定量，研究人员发现10 mg/kg组M2样巨噬细胞比例较溶媒组显著降低（校正后p = 0.021），M1/M2比值升高（p = 0.016），而M1样巨噬细胞绝对增加幅度有限，提示25-HC主要削弱了M2样巨噬细胞的主导状态而非促使全部巨噬细胞向M1极化。
2.6. 25-HC调控肿瘤AMPK/STAT6信号
蛋白质免疫印迹及灰度分析显示，25-HC处理使肿瘤p-AMPK/AMPK比值升至溶媒对照的1.23倍与1.57倍，而p-STAT6/STAT6比值降至0.81倍与0.46倍，表明胆固醇感知与转录调控相关信号通路发生显著重塑。
2.7. 25-HC的抗肿瘤反应在BALB/c裸鼠中减弱
在T细胞缺陷BALB/c裸鼠中，未观察到25-HC对肿瘤体积与重量的剂量依赖性降低；但值得注意的是，裸鼠高剂量组Ki-67阳性率仍下降约三分之一。双因素方差分析显示治疗与宿主的交互作用未达统计学显著（p = 0.06），且裸鼠组个体差异较大，提示不能完全排除低水平效应，但免疫环境缺失确实显著削弱了25-HC的抗肿瘤活性。
讨论部分指出，25-HC的抗肿瘤效应可能同时包含直接抗增殖与免疫环境相关双重成分，但在裸鼠中观察到的Ki-67中间降低因发生于T细胞缺陷宿主，提示可能存在不依赖于适应性T细胞的直接作用，然尚无法排除残余先天免疫细胞或基质细胞的介导效应。关于巨噬细胞极化，研究强调M2优势减弱是核心发现，而非M1细胞的普遍转化。针对AMPK/STAT6信号方向与近期报道的差异，研究人员分析全肿瘤裂解液中不同细胞群体可能贡献差异信号，且口服暴露情境与既往溶酶体蓄积模型存在区别，故当前结果更可能代表多种细胞信号的混合效应。此外，血清与瘤内25-HC的反向模式因仅基于单一时间点测量而仅为描述性观察，其因果机制不明，但提出了免疫细胞相关25-HC处理的科学假说。研究同时坦承多项局限：样本量有限、ELISA对结构类似固醇特异性未独立验证、未开展口服药代动力学研究、未直接验证免疫消耗循环、未进行体外直接作用验证，且缺乏人源样本与临床剂量验证。
研究结论部分指出，口服25-HC在免疫活性BALB/c小鼠中抑制了4T1肿瘤生长，并与肿瘤细胞增殖降低、肿瘤免疫微环境重塑（M2样巨噬细胞优势减弱及细胞毒性效应特征增强）以及肿瘤AMPK/STAT6信号改变相关。BALB/c裸鼠中减弱的反应以及该组中Ki-67的中间降低提示，抗肿瘤效力与直接抗增殖成分及免疫环境相关成分均相容，尽管治疗与宿主的交互作用未达到统计学显著性（p = 0.06），且免疫环境相关性仍属提示性而非确定性。这种反向的血清-肿瘤25-HC模式是一种来自单一时间点的描述性观察，产生了一个关于免疫细胞相关25-HC处理的可检验假说，值得进一步深入研究。
