VAPA依赖性脂质转运在内质网-板层小体接触位点促进人肺表面活性物质形成

《Developmental Cell》：VAPA-dependent lipid transport at ER-lamellar body contact sites promotes human lung surfactant formation

　　

囊泡相关膜蛋白相关蛋白(VAPs)通过与含FFAT基序的蛋白质相互作用，在内质网(ER)与其他细胞器之间建立膜接触位点(MCS)，协调脂质合成、转运和代谢。它们的组织特异性功能仍知之甚少。研究人员报道了一位携带VAPA纯合无义变异(p.(Glu12?))的患者，表现为严重的全面发育迟缓以及进行性表面活性物质功能障碍，导致胆固醇性肺炎和肺纤维化。选择性翻译起始部分绕过提前终止密码子，产生N端截短的VAPA蛋白，其FFAT结合能力受损，并导致人肺泡2型细胞中板层小体(LB)形成障碍。研究人员鉴定了与肺疾病相关的ATP结合盒转运蛋白A3(ABCA3)，它是表面活性物质脂质积累的调节因子，作为VAPA的相互作用伙伴。VAPA-ABCA3相互作用在先前未被表征的ER-LB MCS处促进脂质交换，该功能在VAPA截短时丧失。研究人员的发现确立了VAPA依赖性MCS功能障碍作为综合征性肺病的一种机制，并定义了表面活性物质脂质转运的一条通路。

细胞内细胞器之间的膜接触位点(MCS)是脂质非囊泡转运、钙信号传递及多种信号事件的重要平台。囊泡相关膜蛋白相关蛋白(VAPs)是锚定于内质网(ER)膜上的关键MCS蛋白，其中VAPA和VAPB通过与含双苯丙氨酸酸性区(FFAT)基序的蛋白质相互作用，协调脂质合成、转移与代谢。尽管VAP在体外和细胞水平的功能已有较多研究，但其组织特异性功能仍不清楚；VAPB突变已知导致肌萎缩侧索硬化症8型，而VAPA变异尚未被报道与人类疾病相关。此外，VAPA完全敲除在小鼠中胚胎致死，提示其具有VAPB无法替代的独特功能。本研究报道了首例由VAPA纯合无义变异(p.(Glu12?))导致的严重多系统疾病，并重点阐明其肺部病变的分子机制，旨在揭示VAPA在肺稳态及表面活性物质形成中的作用。

研究人员通过临床和遗传学分析，鉴定了一名携带VAPA c.34G>T (p.(Glu12?))纯合变异的患儿，该患儿表现为全面发育迟缓、进行性肺表面活性物质功能障碍、胆固醇性肺炎和肺纤维化。该变异导致VAPA mRNA逃逸无义介导的mRNA降解，并通过下游替代起始密码子产生N端截短蛋白，其中主要产物为VAPAΔ78。分子动力学模拟和体外结合实验表明，VAPAΔ78的MSP结构域因缺失而结构不稳定，无法有效结合FFAT基序，导致MCS功能缺陷。患者来源的成纤维细胞呈现典型VAPA敲除表型，包括高尔基体反面网络(TGN)上OSBP和CERT的异常累积、中性脂质增加及线粒体形态变圆。进一步研究发现，VAPA与ABCA3（ATP结合盒转运蛋白A3）通过MSP-FFAT相互作用在ER-板层小体接触位点(ER-LB MCS)协同促进胆固醇和磷脂向板层小体(LB)的转运。该过程对肺表面活性物质合成至关重要。该研究首次将VAPA依赖性MCS功能障碍确立为综合征性肺病的发病机制，并定义了表面活性物质脂质转运的一条新通路。

研究采用的主要方法包括：全外显子组测序及Sanger测序鉴定和验证VAPA变异；以患者来源的原代皮肤成纤维细胞为模型，进行qPCR、蛋白质印迹、免疫荧光、RNA测序和脂质组学分析；利用分子动力学模拟预测截短蛋白MSP结构域的结构与动态；通过亲和纯化-质谱(AP-MS)鉴定VAPA相互作用组；采用脂质体浮选实验验证MSP-FFAT结合；在肺泡上皮2型细胞系A549中通过CRISPR敲除VAPA，结合荧光显微镜（包括Tau-STED超分辨成像）和脂质类似物（BODIPY-PC、filipin、脱氢麦角固醇）检测脂质向LB的转运。样本队列来源：患者为近亲婚配的父母的女儿，其母亲为杂合携带者，父亲为野生型；对照为年龄和性别匹配的健康个体。

**患者临床描述**：患儿出生后即出现低体重和小头畸形，2.5月龄时因无眼神接触发现双侧先天性黑矇，3.5岁时表现为严重的全面发育迟缓、喂养困难和进行性小头。肺部影像学显示弥漫性磨玻璃影、小叶间隔增厚和铺路石征，肺泡灌洗液证实肺泡蛋白沉积症(PAP)。肺泡灌洗液脂质组学显示总脂质增加，但主要表面活性物质磷脂磷脂酰胆碱(PC)相对减少，游离胆固醇轻度升高，而胆固醇酯(CE)异常升高，占25%以上。肺组织病理学见蛋白样物质填充、胆固醇裂隙和泡沫细胞，电镜显示约32.7%的板层小体(LB)形态异常。该部分通过临床观察、影像学、脂质组学和病理学明确了疾病表型。

**外显子测序鉴定VAPA纯合变异**：全外显子测序发现VAPA基因c.34G>T (p.(Glu12?))纯合无义变异，Sanger测序验证母源杂合，父源野生型。染色体分析提示18p11.22–18q12.1区域存在单亲二体(isodisomy)，该区域内除VAPA变异外无其他致病性变异，并排除了其他PAP相关基因的突变。这一部分通过遗传学分析确定了致病突变。

**VAPA p.(Glu12?)变异通过下游替代起始密码子导致N端截短蛋白**：患者成纤维细胞中VAPA mRNA水平未降低，提示该变异逃逸无义介导的mRNA降解(NMD)。蛋白质印迹显示缺乏28 kDa全长蛋白，而出现约18 kDa和16 kDa的截短条带。通过构建下游三个可能的起始密码子(M79、M96、M109)突变体，证明M79为主要替代起始密码子，产生缺失前78个氨基酸的VAPAΔ78，M109也有部分贡献。这部分实验揭示了突变产生截短蛋白的分子机制。

**MD模拟预测VAPAΔ78不稳定的MSP结构域和有限的FFAT结合能力**：分子动力学(MD)模拟显示，与野生型MSP相比，VAPAΔ78的MSP结构域仅含两个β链和一个α螺旋，失去保守的VAP共有序列(VCS)，结构不稳定，与OSBP FFAT肽的结合力显著降低，静电相互作用贡献减少。体外脂质体浮选实验进一步证明，VAPAΔ78无法结合OSBP N-PH-FFAT，而野生型VAPA可结合并被竞争肽抑制。这部分从结构和生化层面证实了截短蛋白的功能缺陷。

**患者成纤维细胞呈现VAPA敲除表型**：免疫荧光显示，患者成纤维细胞中OSBP和CERT在TGN的招募显著增加，而总蛋白水平不变，提示ER-TGN MCS处PI4P交换受损。BODIPY染色和液相色谱-质谱(LC-MS)显示脂滴数量及胆固醇酯(CE)、甘油三酯(TG)和醚链TG(TG[O])水平升高。线粒体形态分析显示患者细胞的线粒体较对照更圆，但不如VAPA敲除RPE1细胞严重。这些表型与VAPA敲除细胞的已知表型一致，说明VAPA截短导致功能缺失。

**N端截短的VAPA不能拯救VAPA敲除RPE1细胞**：在VAPA敲除的RPE1细胞中，瞬时表达EGFP-VAPA WT可完全恢复OSBP的胞质定位，而表达EGFP-VAPAΔ78则不能，OSBP在TGN的水平仍保持高水平。同样，表达VAPA WT可恢复线粒体的管状形态，而VAPAΔ78无效。该结果进一步证明VAPAΔ78丧失功能，无法支持VAPA介导的MCS功能。

**转录组分析显示VAPA p.(Glu12?)成纤维细胞中脂质代谢基因激活**：RNA测序显示患者成纤维细胞有1,023个基因上调和719个基因下调。其中超过50个差异表达基因与脂质代谢或转运相关，包括LPCAT1（合成DPPC的关键酶）和多个ABC转运蛋白。基因本体(GO)和KEGG通路富集分析表明，上调基因显著富集于脂质生物合成与代谢过程，提示细胞试图通过转录代偿来恢复脂质稳态。

**VAPA缺乏导致AT2来源细胞系板层小体缺陷**：在A549细胞中敲除VAPA后，ABCA3诱导的LB形成不受影响，但BODIPY标记的磷脂酰胆碱(PC)和游离胆固醇在LB中的积累显著减少。ABCA3含有一个FFAT样基序，且该基序位于胞质侧无序环区。Tau-STED超分辨成像显示，野生型VAPA与ABCA3共定位于ER-LB接触位点，而VAPAΔ78或ABCA3的FFAT突变体(Y518A/F519A)均不能富集于该接触位点。功能实验表明，破坏VAPA-ABCA3相互作用会减少PC和胆固醇在LB中的积累，脱氢麦角固醇(DHE)实验也证实胆固醇转运减少。因此，VAPA和ABCA3形成功能对，通过ER-LB MCS促进脂质向LB的转运，该过程在VAPA p.(Glu12?)突变细胞中受损。

在讨论部分，研究人员指出，尽管VAPA截短蛋白丧失与FFAT结合的能力且无法拯救细胞表型，但患者能存活至儿童期，可能因突变并非完全敲除，残留部分功能或存在遗传修饰因素。VAPB在患者细胞中未代偿性上调，且不能完全替代VAPA功能。患者肺泡灌洗液中高CE和胆固醇裂隙提示表面活性物质回收障碍和脂质代谢紊乱，可能与VAPA缺失导致胆固醇向LB转运减少及随后在胞质内酯化有关。视网膜和皮肤表型可能分别与ER-过氧化物酶体接触异常和角质形成细胞板层小体成熟障碍有关。该研究局限性为仅一例患者，但为后续发现更多VAPA变异提供了依据。研究人员总结并翻译结论：VAPA和ABCA3在ER-LB MCS处形成功能性配对，促进胆固醇及其他脂质在LB内的累积。脂质向LB的转运是表面活性物质形成的关键步骤，该过程在表达由VAPA p.(Glu12?)突变衍生的主要截短蛋白的细胞中受损，提示ER-LB MCS处的脂质转运缺陷可能参与该病的肺部表型。