苯基取代苯并咪唑类毒蕈碱乙酰胆碱受体拮抗剂的代谢稳定性与生物转化：整合体外与计算研究

《Pharmaceuticals》：Metabolic Stability and Biotransformation of Muscarinic Receptor Antagonists: An Integrated In Vitro Study

背景/目的：代谢稳定性是候选药物药代动力学性质的重要决定因素，因为代谢不稳定可能限制全身暴露并导致具有不同药理特性的代谢物形成。本研究采用整合的体外与计算机模拟方法，表征了五种苯基取代苯并咪唑类毒蕈碱乙酰胆碱受体（muscarinic acetylcholine receptor, mAChR）拮抗剂的I相代谢稳定性和生物转化途径。方法：在人肝微粒体（human liver microsomes, HLM）中，使用液相色谱联用高分辨质谱和串联质谱研究代谢稳定性、微粒体结合和代谢物形成。使用GLORY、GLORYx和FAME3R对可能的代谢位点进行排序，同时应用SwissADME估算母体化合物和推定代谢物的理化及药代动力学性质。进一步使用分子对接探索代谢转化对靶标相互作用的潜在影响。结果：化合物4表现出最快的代谢周转，而1在经微粒体结合校正后显示出最高的内在代谢稳定性。羟基化是最常观察到的I相转化，N-脱甲基在整个系列中均被检测到。几个推定代谢物被预测具有P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）底物识别和脑渗透降低的特性，而母体化合物除4外均未被预测为P-gp底物。结论：该研究明确了该苯并咪唑类mAChR拮抗剂系列中的主要代谢转化途径，并识别了可能与进一步化合物优化相关的代谢弱点。实验与计算相结合的方法为解释代谢谱和生成后续药代动力学及构效关系研究的假设提供了框架。

毒蕈碱乙酰胆碱受体（muscarinic acetylcholine receptor, mAChR）属于G蛋白偶联受体超家族，在认知、记忆和突触可塑性调控中发挥关键作用，其功能异常与阿尔茨海默病、帕金森病、精神分裂症及认知障碍等密切相关。然而，mAChR各亚型（M1–M5）正构位点序列高度同源，开发亚型选择性配体及可用于正电子发射断层扫描（positron emission tomography, PET）的示踪剂仍面临重大挑战。现有mAChR示踪剂常因亚型选择性不足、药代动力学不佳或代谢不稳定而受限。代谢稳定性是候选药物药代动力学性质的重要决定因素：代谢不稳定会限制全身暴露，并可能产生具有不同药理活性的代谢物。对PET示踪剂而言，放射性代谢物会干扰定量分析和动脉输入函数，尤其能穿透血脑屏障（blood–brain barrier, BBB）的代谢物会严重损害成像质量。因此，表征候选化合物的代谢转化途径具有重要的实际意义。本研究针对一系列新近报道的苯基取代苯并咪唑类正构mAChR拮抗剂（化合物1–5），其结构含有叔胺和芳香环，易发生N-脱甲基和羟基化等I相代谢，但具体代谢行为尚未阐明。研究人员因此建立了整合体外与计算机模拟的工作流，系统评估其I相代谢脆弱性。

研究人员通过人肝微粒体（human liver microsomes, HLM）孵育结合液相色谱-高分辨质谱（liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry, LC-HRMS）和串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS），测定了五种化合物的代谢稳定性、微粒体结合及代谢物形成；利用GLORY、GLORYx和FAME3R预测代谢位点，SwissADME估算理化与药代动力学性质，分子对接评估代谢物与mAChR亚型的相互作用。研究明确了羟基化是主导转化途径，N-脱甲基在所有化合物中一致出现；化合物4代谢最快，而1经微粒体结合校正后内在稳定性最高；多种代谢物被预测为P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）底物，可能被BBB外排，而母体化合物除4外均不是P-gp底物。该工作揭示了该系列化合物的主要代谢途径和代谢弱点，为后续结构优化和PET示踪剂开发提供了框架。

关键技术方法包括：采用HLM孵育体系（底物浓度2.50 μM，蛋白浓度0.5 mg/mL），以LC-HRMS定量和LC-MS/MS鉴定代谢物；通过Michaelis–Menten动力学确定饱和浓度；运用快速平衡透析测定未结合分数（f_u,mic）；使用GLORY、GLORYx和FAME3R（通过NERDD平台）预测代谢位点；应用SwissADME计算ADME性质；利用LigandScout和AutoDock Vina进行分子对接，受体结构取自PDB（CHRM1: 5CXV, 6ZG9; CHRM2: 3UON, 4MQS; CHRM3: 8EA0; CHRM4: 5DSG; CHRM5: 6OL9）。人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas, HPA）的RNA表达数据用于参考受体分布。

2.1 通过LC-HRMS对化合物1–5进行定量分析：研究人员采用内标（1-甲基吡咯烷-3-基 N,N-二苯基氨基甲酸酯）进行峰面积归一化，基于精确m/z生成提取离子色谱图，实现了五种化合物的准确定量。

2.2 人肝微粒体中LC-HRMS方法的验证：方法在HLM基质中验证，线性范围0.05–5.00 μM，R²>0.999；准确度（相对误差RE）在?10.1%至10.4%（批内）和?10.4%至10.9%（批间），精密度RSD不超过15.3%，符合ICH指南要求；检测限（LOD）为0.03 μM，定量限（LOQ）为0.05 μM。

2.3 米氏动力学：对化合物1的底物消耗速率进行了浓度依赖性分析，符合经典米氏方程，表观米氏常数K_m=2.45 μM，最大反应速率V_m=5.03 pmol/min/mg蛋白。基于此选择2.50 μM作为后续所有实验的底物浓度，该浓度低于饱和范围且足以检测低丰度代谢物。

2.4 微粒体结合研究：利用快速平衡透析装置测得五种化合物的f_u,mic为0.272–0.412，化合物1最高（0.412），3最低（0.272）。f_u,mic与计算logP（cLogP）呈中度负相关（r=?0.71），与拓扑极性表面积（tPSA）和pKa相关性弱。

2.5 人肝微粒体中的代谢稳定性：在120 min孵育中，所有化合物均呈时间依赖性消耗。单因素方差分析显示剩余浓度差异显著（F(4,10)=493.4, p<0.0001），稳定性顺序为3>1>5>2>4。化合物4几乎完全消耗，显著快于其他化合物。经f_u,mic校正后，1具有最低的未结合内在清除率（Cl_int,u），表明其内在代谢稳定性最高。

2.6 人肝微粒体孵育期间的代谢物形成：基于精确质量、保留时间和MS/MS碎片鉴定代谢物。羟基化是主要反应，N-脱甲基在所有化合物中均被检测到。化合物1、2、4、5各形成4种代谢物（一种N-脱甲基、两种芳香羟基化、一种脂肪族羟基化），3形成5种代谢物（多一种芳香羟基化）。相对形成量（120 min归一化峰面积）显示N-脱甲基为0.2%–4.4%，芳香羟基化为0.7%–48.4%，脂肪族羟基化为0.5%–25.4%。所有脂肪族羟基化代谢物均未观察到特征性CH₂O丢失，提示并非N-羟甲基。

2.7 计算机模拟代谢物预测：GLORY、GLORYx和FAME3R均预测羟基化和N-脱甲基为主要转化，并一致预测N-氧化，但实验中未检测到N-氧化产物。预测的羟基化位点优先级与MS/MS数据一致：脂肪族羟基化倾向发生在甲基取代基和叔胺环，芳香羟基化倾向发生在苯并咪唑的邻/对位。预测结果用于补充MS/MS无法区分的羟基化位置。

2.8 SwissADME预测及与靶位点的结合模式：SwissADME分析显示，母体化合物和推定代谢物均被预测可穿透BBB，且药代动力学特征总体相似。然而，1、2、4、5的代谢物被预测为P-gp底物，可能受到脑外排，而母体化合物（除4外）均不是P-gp底物。分子对接表明，代谢物与母体的结合姿势总体相似，但相对结合分数因化合物和亚型而异：N-脱甲基对1和2产生更有利的结合分数，对3影响小，对4和5不利；芳香羟基化通常降低结合分数（例外是1在CHRM2上）；脂肪族羟基化对1和2有利，对3、4、5不利。

讨论部分指出，代谢易感性受结构影响，微粒体结合校正对于排序至关重要。对于碳-11标记，N-脱甲基发生在标记位点时会释放[¹¹C]甲醇，随后氧化为[¹¹C]CO₂呼出，不产生干扰性放射代谢物；而羟基化远离标记位点，会保留放射性，构成主要放射代谢物池。尽管代谢物被预测可穿透BBB，但P-gp底物特性可能限制其脑内浓度。分子对接显示代谢物仍可能进入正构位点，因此不能排除靶标相互作用。局限性包括未包含II相代谢、未使用真实标准品确认结构（除4的N-脱甲基代谢物）、计算预测需要实验验证。

结论：本研究结合HLM孵育、LC-HRMS、LC-MS/MS和计算预测，表征了五种苯并咪唑类mAChR拮抗剂的I相代谢。羟基化是主要途径，N-脱甲基在N-甲基位点一致发生。经微粒体结合校正后，1具有最低的Cl_int,u，表明其代谢稳定性最高。对于含两个N-甲基的5，其N-脱甲基产生4，因此可通过真实标准品鉴定。代谢不稳定和代谢物形成是药物开发的重要考虑因素；对CNS活性化合物，代谢影响全身暴露和脑靶点到达。预测显示母体和代谢物大多可穿透BBB，但多个代谢物是P-gp底物，其净脑暴露可能受外排影响。分子对接提示生物转化可改变与mAChR亚型的相互作用。这些发现支持从代谢稳定性、代谢物形成、BBB进入、外排到靶标结合的顺序评估代谢影响。该工作流对分子影像剂早期开发有价值，可指导标记位置选择和成像数据解释。