《Biomolecules》：Integrated Single-Cell Transcriptomics and Metabolomics Reveal Potential Associations Between Monascus pilosus Fermentation Metabolites and Diabetes-Related Pancreatic Transcriptional Networks
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## 三、摘要专业翻译
糖尿病（diabetes mellitus）是一种以免疫—代谢失调为特征的全球性代谢疾病，但其发病机制仍不明确。药食两用真菌红曲霉（*Monascus*）来源的天然产物具有降血糖活性，然而由于缺乏对细胞异质性和分子靶点的系统性认识，其
## 三、摘要专业翻译
糖尿病（diabetes mellitus）是一种以免疫—代谢失调为特征的全球性代谢疾病，但其发病机制仍不明确。药食两用真菌红曲霉（*Monascus*）来源的天然产物具有降血糖活性，然而由于缺乏对细胞异质性和分子靶点的系统性认识，其临床转化受到限制。研究人员整合了公共单细胞转录组数据（GSE101207）与本实验室21份红曲霉非靶向代谢组学数据集，开展了单细胞分析、代谢通讯推断、差异代谢物交集分析、三种机器学习算法（Lasso回归、支持向量机—递归特征消除、随机森林）、网络药理学、免疫细胞浸润评估以及虚拟基因敲除分析。胰腺导管细胞（pancreatic ductal cells，PDCs）表现出与糖尿病最高的疾病关联评分，并被预测高度参与代谢物介导的串扰。研究识别出4个候选重叠代谢物和3个候选基因——次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1（hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1，HPRT1）、β-甘露糖苷酶（mannosidase beta，MANBA）和鸟氨酸脱羧酶1（ornithine decarboxylase 1，ODC1）。预测HPRT1与IL-17及TGF-β通路相关；MANBA与ECM—受体相互作用及TNF信号相关；ODC1与NF-κB及NOD样受体通路相关。上述基因与免疫亚群呈现探索性关联，CIBERSORT估算的糖尿病组记忆B细胞与CD8+ T细胞比例在数值上较高，尚需进一步验证。虚拟基因敲除预测，扰动上述任一基因均可重塑炎症—代谢相关转录网络。该多维框架提示红曲霉发酵来源代谢物与涉及PDCs及HPRT1/MANBA/ODC1基因集的糖尿病相关胰腺转录网络之间存在潜在关联。小鼠胰腺导管上皮细胞的体外qRT-PCR部分支持了糖尿病样条件下HPRT1与ODC1上调、以及红曲霉发酵代谢物处理后其表达降低的预测。该研究为后续实验验证提供了假说生成框架，并为阐明天然产物作用机制提供了新模型。
## 四、论文主体解读
**研究背景与科学问题**
糖尿病（diabetes mellitus，DM）已成为全球性慢性非传染性疾病，2021年国际糖尿病联盟（International Diabetes Federation，IDF）统计显示其影响全球10.5%的成人，约5.37亿患者，其中2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）占90%以上，预计2045年患者总数将达7.83亿（12.2%）。中国成人糖尿病患者超过1.4亿，居全球首位，且发病呈年轻化趋势。糖尿病通过胰岛β细胞功能逐渐衰退与胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）形成恶性循环，慢性高血糖不仅直接损伤胰岛微环境，还系统性破坏糖脂代谢稳态，诱导慢性低度系统性炎症即"代谢性炎症"（metaflammation）。分子层面，AKT1、INS、PPARG、SIRT1等关键代谢调控基因显著失调，并伴磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）—Akt与AMP活化蛋白激酶（AMPK）信号通路异常。临床现有阶梯式治疗（生活方式干预联合二甲双胍为一线，继而磺脲类、DPP-4抑制剂、SGLT-2抑制剂、GLP-1受体激动剂或基础胰岛素）虽能有效控糖，但存在血糖波动、体重增加、低血糖风险、药物不耐受及长期依从性差等问题，且单纯强化降糖不能完全阻止微血管与大血管并发症，因此多靶点、多通路的综合管理策略日益受重视。
红曲霉为药食两用真菌，其发酵产物（莫纳可林K、红曲色素、γ-氨基丁酸等）已被证实具有调脂、抗炎、抗氧化及改善胰岛素抵抗等活性，但其治疗糖尿病的系统作用机制，尤其是单细胞分辨率下的细胞类型特异性调控网络，以及候选重叠代谢物与靶点之间的直接关联仍不清楚，严重制约其临床转化。传统药理学研究局限于整体动物或混合细胞群的平均响应，无法解析糖尿病相关组织（尤其胰腺）内部的细胞异质性，也难以建立分子靶点与功能代谢结局的直接因果关联。单细胞RNA测序（scRNA-seq）可在单细胞分辨率绘制疾病组织转录图谱并识别与疾病进展相关的稀有细胞亚群；网络药理学可通过"药物—成分—靶点—通路"多层互作网络系统预测天然产物多靶点机制；代谢组学可无偏评估代谢通路扰动与恢复。但单一组学各有盲区：网络药理学缺乏细胞类型特异性，代谢组学无法追溯代谢变化的细胞来源，scRNA-seq无法平行直接测定代谢物层面的功能输出。因此，整合多组学数据构建"细胞亚群—关键代谢物—核心靶点—信号通路"多层调控网络成为必然趋势。本研究据此首先分析T2DM胰腺单细胞数据集GSE101207，发现糖尿病组胰腺导管细胞（pancreatic ductal cells，PDCs）疾病关联评分最高，提示其可能是糖尿病病理过程中的关键应答细胞群；随后通过MEBOCOST代谢通讯分析识别多条代谢物介导的细胞间互作；同时对亲本红曲霉MS-1及其突变株ΔMpclr4不同发酵时间点样本进行非靶向代谢组学检测，鉴定1044个候选差异代谢物，其中鸟苷（guanosine）、胞苷（cytidine）、L-谷氨酰胺（L-glutamine）与胸苷（thymidine）与MEBOCOST预测代谢物重叠，定义为候选重叠代谢物；经网络药理学预测，4个候选重叠代谢物对应238个预测靶点，与糖尿病疾病靶点交集后得224个候选关联靶点；再用Lasso回归、SVM-RFE与随机森林三种机器学习算法筛选，获得HPRT1（hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1）、MANBA（β-mannosidase）与ODC1（ornithine decarboxylase 1）三个重叠关键基因；最后以GSEA、GSVA、免疫浸润分析及单细胞虚拟基因敲除（scTenifoldKnk）评估三基因行为及其对糖尿病信号通路的调控。总体而言，本研究构建了整合单细胞转录组学、代谢组学、网络药理学、机器学习与虚拟敲除技术的计算框架，提示红曲霉发酵代谢物、HPRT1/MANBA/ODC1基因集与糖尿病下游免疫—代谢通路之间存在潜在关联，为后续实验验证与临床评价提供假说生成基础。
**关键技术方法（约240字）**
研究整合多组学框架：胰腺单细胞RNA-seq数据来自GEO的GSE101207（6例非糖尿病对照与3例T2DM供体），批量胰岛转录组数据为GSE76896（116例对照与55例糖尿病）；对源自MS-1与ΔMpclr4菌株、发酵7、14、21天的21份红曲霉发酵样本进行非靶向代谢组学分析（含3份未发酵空白对照，仅用于质控，不作生物学比较）。经Seurat（v4.3.0）与Harmony（v1.2.3）质控与批次校正后注释细胞类型，并以MEBOCOST推断代谢物介导的细胞间通讯；limma筛选差异代谢物（|log2FC| > 0.585，名义p < 0.05，并行Benjamini–Hochberg FDR校正，采用~strain*time双因素模型）后与MEBOCOST预测代谢物取交集；SwissTargetPrediction预测人源靶点并与GeneCards糖尿病靶点（相关性评分 > 1）交集；以LASSO回归、SVM-RFE与随机森林筛选候选基因；进而开展GSEA、GSVA、CIBERSORT（v1.03）免疫解卷积与scTenifoldKnk（v1.0.2）虚拟敲除分析；最后在小鼠胰腺导管上皮细胞中以qRT-PCR（2
?ΔΔCt法，β-actin为内参）验证。统计均在R v4.2.2中完成，双侧检验。
**研究结果**
*单细胞数据质控与聚类*：多样本数据质量综合评估剔除离群细胞及基因表达计数低于200的细胞，最终获得20486个高质量细胞，鉴定2000个高变基因，并完成标准化、缩放、主成分分析（PCA）与Harmony批次效应校正。
*细胞注释*：经统一流形近似与投影（UMAP）降维获得9个亚簇，注释为8种细胞类型：Gamma_cells、Beta_cells、Alpha_cells、Delta_cells、胰腺星状细胞（PSCs）、PDCs、Acinar_cells与内皮细胞（cluster 0与6合并注释为Alpha_cells），标记基因气泡图证实注释准确性，并绘制各组细胞比例柱状图。
*亚簇差异富集分析与关键细胞亚群鉴定*：以FindAllMarkers鉴定各亚簇差异表达基因并提取logFC最大的5个基因，结合ClusterGVis（v0.1.2）、org.Hs.eg.db（v3.17.0）与visCluster进行富集分析与矩阵可视化，发现PDC相关差异表达特征富集于中间丝组装及中间丝细胞骨架组装等生物学过程；以epitools计算期望值并求观测值与期望值之比（Ro/e），结果显示PDCs在疾病组评分最高。但供体感知伪批量（Wilcoxon检验）与混合效应模型显示HPRT1（p = 0.154；p = 0.297）、MANBA（p = 0.694；p = 0.328）与ODC1（p = 0.905；p = 0.583）在PDC比例上无显著差异，提示因糖尿病供体仅3例而统计效能不足，故Ro/e仅作为描述性指标，验证依赖体外qRT-PCR。
*MEBOCOST分析*：代谢物介导的细胞间通讯（mCCC）中不同细胞类型作为信号发送者与接收者的活性及功能偏好存在显著差异；PDCs作为发送者可启动13个mCCC事件、作为接收者可接收17个事件，被预测为代谢物介导细胞间通讯的枢纽。通讯网络显示Alpha_cells、Beta_cells、Delta_cells、Gamma_cells、PDCs与PSCs间互作最显著，内皮细胞连接较少；Beta_cells整体通讯活性最高，且Beta_cells自身间通讯强度最大（气泡最大、总分最高），提示β细胞存在大量自分泌或旁分泌调控。研究指出疾病关联评分与MEBOCOST通讯强度为不同指标：前者反映糖尿病样本中的富集，后者反映预测通讯强度，PDCs受关注源于其最强的组特异性富集而非最高通讯活性。
*差异代谢物与候选重叠代谢物鉴定*：在12845个检测代谢物中，6931个呈显著菌株主效应、10155个呈显著时间主效应、7310个呈显著菌株×时间交互效应（FDR < 0.05）；按名义p < 0.05且|log2FC| > 0.585筛选获1044个候选差异代谢物（308个上调、736个下调），其中963个（92.2%）经BH-FDR校正后仍显著（q < 0.05）。MEBOCOST识别的20个代谢物中观察到脂质代谢重塑与氧化应激相关变化，如ω-3多不饱和脂肪酸（DHA、EPA）及谷胱甘肽等抗氧化相关代谢物升高，预测炎症减轻与胰岛素敏感性潜在改善；核苷与氨基酸代谢物（腺苷、L-谷氨酰胺、GABA）变化反映能量代谢与β细胞功能稳态恢复。20个MEBOCOST预测代谢物中16个为独有、4个与实验差异代谢物重叠，交集得4个候选重叠代谢物（鸟苷、胞苷、L-谷氨酰胺、胸苷），其定义为计算学重叠而非直接生物活性，基于数据库匹配与提取离子色谱，未经绝对定量或标准品确证，属暂定归属；QC样本中位相对标准偏差（RSDs）全部代谢物为0.7%、4个候选物为0.1–0.4%。研究还比较了MS-1与ΔMpclr4间及同菌株不同发酵时间点的次级代谢物含量差异。
*候选重叠代谢物预测靶点与糖尿病疾病靶点检索*：经PubChem获取化学结构，以SwissTargetPrediction预测并仅保留人源靶点，共得238个靶点并以Cytoscape（v3.10.1）可视化；与GeneCards糖尿病疾病靶点交集得224个靶基因。
*候选关键基因鉴定*：对224个基因应用三种算法，Lasso回归鉴定19个特征基因；SVM-RFE在保留22个特征基因时分类准确率最高；随机森林按%IncMSE选取前10个特征基因；三者交集得HPRT1、MANBA与ODC1三个重叠基因作为后续关键基因，推测其可能通过调控核苷酸补救合成通路与氨基酸代谢通量成为与化合物预测药理效应相关的候选分子组分。研究说明机器学习衍生基因特征无独立验证队列，且鉴于单细胞数据的显著细胞类型特异性表达，未在GSE76896中进行批量层面比较。
*GSEA*：HPRT1相关富集于细胞因子—细胞因子受体相互作用、IL-17信号通路与TGF-β信号通路；MANBA相关富集于ECM—受体相互作用、TNF信号通路与钙信号通路；ODC1相关富集于NF-κB信号通路、HIF-1信号通路与NOD样受体信号通路。
*GSVA*：HPRT1相关富集于PANCREAS_BETA_CELLS、BILE_ACID_METABOLISM与HEDGEHOG_SIGNALING基因集；MANBA相关富集于MYOGENESIS、ESTROGEN_RESPONSE_EARLY与COAGULATION等生物学程序；ODC1相关富集于MTORC1_SIGNALING与MYC_TARGETS_V2等功能程序，提示关键基因可能通过上述功能通路影响疾病演进。
*免疫浸润与免疫调控因子*：探索性CIBERSORT解卷积估算糖尿病组记忆B细胞与CD8
+ T细胞比例数值较高、初始B细胞与活化树突状细胞较低，但鉴于LM22在胰岛组织表现较差，仅为探索性结果。HPRT1与估算记忆B细胞及CD8
+ T细胞正相关、与初始CD4
+ T细胞及调节性T细胞（Tregs）负相关；MANBA与估算M2巨噬细胞及浆细胞正相关、与γδ T细胞及活化肥大细胞负相关；ODC1与估算初始B细胞及活化树突状细胞正相关、与M2巨噬细胞及CD8
+ T细胞负相关。三基因还与多种免疫抑制因子、免疫刺激因子、趋化因子及其受体呈探索性相关。
*关键基因表达与敲除*：以FeaturePlot与VlnPlot可视化三基因在单细胞中的表达；scTenifoldKnk虚拟敲除后提取差异调控结果中倍数变化（FC）最大的前20个基因并以标准化条形图展示，随后对受影响靶基因进行GO与KEGG分析。基于scTenifoldKnk构建10个独立子网络并行计算机基因敲除，以张量分解（K = 3）计算网络扰动评分并取均值作为最终评分，以FDR校正p值（adj.p < 0.05）为显著性标准。
*qRT-PCR验证*：在小鼠胰腺导管上皮细胞中，扩增曲线与熔解曲线显示所有目标基因及内参β-actin特异性扩增。高糖+棕榈酸模型组HPRT1表达较正常对照组升高（2.839、2.556、2.530 vs. 1.000、0.912、0.898），低剂量与高剂量发酵代谢物处理使其降低（分别为2.295、2.148、2.190与1.965、2.024、2.093），但仍高于对照；MANBA在模型组轻微升高（1.158、1.111、0.996 vs. 1.000、0.935、1.062），低、高剂量处理后下降（0.835、0.965、1.029与0.758、0.940、1.001）；ODC1在模型组显著升高（4.871、4.708、4.506 vs. 1.000、0.855、0.924），经低、高剂量处理降低（3.621、3.805、4.266与2.482、2.821、2.832），呈剂量依赖趋势。上述体外结果支持HPRT1、MANBA与ODC1在糖尿病样条件下失调并可被红曲霉发酵代谢物调控的计算预测，但验证在小鼠模型而非人糖尿病胰腺组织中进行，仍需进一步验证。
**讨论部分总结**
讨论首先指出糖尿病为全球公共卫生危机，中国成人患病率达12.8%而血糖控制达标率不足50%，长期管理需综合调控血脂、血压、体重与炎症状态并定期监测糖化血红蛋白与尿微量白蛋白，但临床仍缺乏可预测疾病进展、指导分层管理与评估天然产物治疗反应的可靠分子标志物。本研究通过多组学与机器学习计算识别HPRT1、MANBA与ODC1三个候选基因，视为整合计算预测框架所鉴定的分子组分；单细胞分析显示糖尿病组PDCs疾病关联评分最高，预测PDCs不仅是传统导管上皮细胞，还可能通过代谢通讯参与糖尿病病理过程；结合MEBOCOST揭示的代谢物介导细胞间通讯网络，推测红曲霉候选重叠代谢物可能与PDCs及其相关信号通路关联，进而影响整个胰腺微环境；强调三基因需独立实验验证方可视为生物标志物或治疗靶点。其次，免疫失调是糖尿病发病核心驱动因素之一，T2DM患者及动物模型存在免疫亚群显著失衡：CD8
+ T细胞向胰岛与脂肪组织浸润增加、促进β细胞损伤与胰岛素抵抗，记忆B细胞呈扩增趋势，而Tregs与M2巨噬细胞相对减少；本研究探索性解卷积估算糖尿病组记忆B细胞与CD8
+ T细胞比例数值较高、初始B细胞与活化树突状细胞较低，但受LM22矩阵在胰岛组织表现不佳限制，仅为适应性免疫活化模式的松散提示。三基因与估算免疫细胞比例及多种免疫因子的相关性提示其不仅与代谢调控相关，还可能与糖尿病免疫微环境重塑有关；鉴于PDCs在疾病组评分较高，推测红曲霉可能通过调节PDCs分泌的趋化因子或代谢物间接影响免疫细胞募集与功能状态，该假说需后续空间转录组技术验证。机制层面，HPRT1为嘌呤补救合成通路关键酶，催化次黄嘌呤转化为次黄苷酸（IMP），维持细胞核苷酸池平衡，其异常表达与细胞增殖、氧化应激及炎症反应密切相关；GSEA显示其富集于细胞因子—细胞因子受体相互作用、IL-17与TGF-β通路，已知IL-17通路可通过诱导促炎细胞因子（IL-6、TNF-α）破坏胰岛素信号通路并促进β细胞凋亡，TGF-β通路在胰岛纤维化与上皮—间质转化（EMT）中起关键作用而PDCs是EMT相关分子的重要细胞来源；GSVA显示其富集于PANCREAS_BETA_CELLS通路，单细胞表达谱显示其在PDCs及部分免疫细胞高表达；虚拟敲除后下游差异调控基因主要富集于炎症反应与细胞因子信号通路，提示HPRT1可能参与炎症信号，总体上可能与经IL-17/TGF-β轴的红曲霉免疫调节通路相关。MANBA编码β-甘露糖苷酶，为参与N-连接糖蛋白降解的关键溶酶体酶，其表达缺陷致罕见β-甘露糖苷贮积症；近期研究证实溶酶体功能障碍不仅与神经退行性疾病相关，也参与胰岛素抵抗与T2DM发病；本研究发现其富集于ECM—受体相互作用、TNF与钙信号通路，ECM—受体互作异常与胰腺纤维化及胰岛结构破坏直接相关，TNF通路是代谢性炎症核心枢纽、可通过激活NF-κB加重胰岛素抵抗；GSVA显示其亦富集于MYOGENESIS与COAGULATION通路，预测其可能参与糖尿病相关肌少症与高凝状态；虚拟敲除后受影响靶基因显著富集于溶酶体与炎症相关通路，进一步提示MANBA可能经溶酶体—炎症轴与糖尿病相关通路计算关联；鉴于PDCs在糖尿病组评分较高，推测PDCs中MANBA异常表达可能通过影响外分泌—内分泌串扰间接加重β细胞功能障碍。ODC1为多胺生物合成首要限速酶，催化鸟氨酸脱羧生成腐胺，在多胺代谢、细胞增殖与氧化应激中起关键作用；本研究显示其富集于NF-κB、HIF-1与NOD样受体信号通路，NF-κB为炎症反应核心转录调控模块，HIF-1介导缺氧条件下代谢重编程，二者均与糖尿病肾病肾小管损伤及胰岛缺氧应激密切相关，NOD样受体通路直接参与炎症小体活化与IL-1β成熟、可加重胰岛素抵抗；GSVA显示其富集于MTORC1_SIGNALING与MYC_TARGETS_V2，已知mTORC1通路异常激活可抑制胰岛素信号并促进β细胞去分化；虚拟敲除后下游靶基因主要涉及NF-κB与mTOR相关通路，与上述研究高度一致，总体上ODC1可能经NF-κB与mTORC1通路与糖尿病代谢性炎症及细胞增殖计算关联。研究进一步提出多维机制模型：红曲霉发酵产生的候选重叠代谢物可能与候选基因HPRT1、MANBA与ODC1关联，并可能影响炎症信号通路（IL-17、TNF、NF-κB）与代谢信号通路（mTORC1、HIF-1），进而与胰腺免疫微环境及β细胞功能相关，但尚待实验验证；单细胞分析中PDCs为糖尿病组评分最高细胞亚群，可通过外分泌信号与代谢物—传感器网络成为红曲霉代谢物的重要靶细胞；临床层面三基因需未来独立验证方可评估糖尿病进展与对红曲霉的潜在反应。研究同时坦陈局限：多组学整合与虚拟敲除仅提供相关性与网络调控证据，三基因在糖尿病中的直接功能及红曲霉活性成分具体调控机制仍需基因敲除/过表达动物模型与细胞实验（如PDCs原代培养）功能验证，且候选基因仅在训练数据集识别、需独立队列验证；单细胞数据来自公共数据库GSE101207、样本量有限且缺乏红曲霉干预后胰腺单细胞转录组数据，未来应在自建红曲霉干预模型中开展scRNA-seq直接评估细胞类型特异性效应，尤其仅含3例糖尿病供体限制了普适性；代谢组学候选重叠代谢物与三基因的直接互作尚未经表面等离子共振（SPR）与细胞热位移分析（CETSA）验证，未进行带标准品与绝对定量的靶向LC-MS/MS，且代谢物系红曲霉直接产生还是源自培养基尚不清楚，需绝对定量与稳定同位素示踪；scRNA-seq丢失组织空间位置信息，需空间转录组技术（如Visium）验证PDCs等亚群原位分布及其与免疫细胞互作；基于CIBERSORT的免疫解卷积受限于未针对胰岛组织优化的LM22参考矩阵，171份样本中仅1份通过解卷积p < 0.05阈值、平均相关系数0.005、RMSE为1.092，故所有免疫浸润结果均为探索性、需以胰岛特异性参考矩阵或单细胞衍生特征验证；研究未区分红曲霉不同活性成分各自贡献，需经活性导向分离与成分敲除/回补实验明确药效物质基础；鉴于缺乏实验验证（仅小鼠胰腺导管上皮细胞qRT-PCR），现阶段不能得出确定性生物学结论。
**结论翻译**
通过整合单细胞转录组学、代谢组学与网络药理学，本研究提供了一个跨尺度框架，用于识别胰腺导管细胞作为疾病相关细胞亚群并预测其参与代谢通讯，以及将鸟苷、胞苷、L-谷氨酰胺与胸苷界定为与红曲霉发酵相关的候选重叠代谢物。计算分析提示这些代谢物可能与由HPRT1、MANBA与ODC1组成的候选基因集相关，该基因集被预测参与炎症与代谢信号网络，并与来自糖尿病胰岛转录组的估算免疫相关转录组信号呈探索性相关，但仍需进一步验证。对上述各基因的计算机扰动预测炎症—代谢相关转录网络发生显著变化。总体而言，这些计算发现提示红曲霉发酵来源代谢物、胰腺导管细胞与HPRT1/MANBA/ODC1基因集之间存在潜在关联，并可能与糖尿病胰腺免疫微环境相关，值得进一步实验研究。本研究还为生成天然产物机制假说提供了多组学框架，并将这三个基因确定为供未来验证的候选基因而非确立生物标志物。值得注意的是，小鼠胰腺导管上皮细胞的体外qRT-PCR验证进一步支持了上述计算预测，显示HPRT1与ODC1在糖尿病样条件下上调、经红曲霉发酵代谢物处理后降低，而MANBA仅呈轻微变化。
