锌（Zn2+）依赖性调控高分子量激肽原（HMWK）与接触系统：对炎症、血栓形成及血管功能障碍的意义

《Biomolecules》：Zinc-Dependent Regulation of High-Molecular-Weight Kininogen and the Contact System: Implications for Inflammation, Thrombosis and Vascular Dysfunction

　　

高分子量激肽原（HMWK）是一种多功能血浆糖蛋白，既作为缓激肽（BK）的前体，又是接触激活途径中的关键辅因子。通过与凝血因子XII、凝血因子XI、前激肽释放酶及多种生物表面相互作用，HMWK协调接触系统组装，并连接凝血、炎症和血管生物学。越来越多的证据表明，这些相互作用中的许多受到Zn²⁺的强烈调控，尤其通过富含组氨酸的D5结构域介导，该结构域参与其与细胞受体、细胞外基质及带负电激活表面的结合。Zn²⁺促进HMWK及相关接触因子的定位，促进接触激活，并影响完整HMWK和裂解型HMWK的生物学活性。新近研究还提示，细胞外锌形态（zinc speciation）的改变，包括由白蛋白-脂肪酸-锌转换（albumin-fatty acid-zinc switch）所驱动的改变，可能调节HMWK功能，并参与与炎症和血栓形成相关的疾病过程。除公认的BK生成作用外，HMWK还参与血管生成、宿主防御以及对淀粉样聚集体等病理性表面的应答等多种过程。尽管对接触系统生物学的认识已有显著进展，但关于Zn²⁺结合的分子基础、HMWK的结构组织以及体内（in vivo）接触激活的调控机制等关键问题仍未阐明。本综述总结了HMWK结构与功能的现有知识，重点强调Zn²⁺依赖性调控以及锌形态在健康和疾病中的潜在重要性。

1. 激肽原与接触系统（Kininogens and the Contact System）
激肽原为多功能、非酶性血浆糖蛋白，位于凝血与炎症的交界。KNG1基因经可变剪接产生低分子量激肽原（LMWK）和高分子量激肽原（HMWK）。二者主要由肝脏合成，HMWK血浆浓度约为70–80 μg/mL（约0.6–0.7 μM），LMWK约为45–120 μg/mL。LMWK经组织激肽释放酶裂解释放Lys-BK，HMWK经血浆激肽释放酶（plasma kallikrein）生成BK。HMWK可与血小板、内皮细胞和粒细胞表面结合，促进接触系统组分的组装与调控。接触系统核心由凝血因子XII（FXII）、前激肽释放酶（PK）和HMWK组成；HMWK促进这些组分在带负电生物表面组装。凝血因子XI（FXI）虽与接触系统密切并可被FXIIa激活，但通常被视为主要属于内源性凝血途径。经典接触激活由FXII接触糖胺聚糖、多聚磷酸（polyP）、细胞外DNA、内毒素或淀粉样物质等表面触发，表面结合诱导FXII构象变化并促进其活化为FXIIa；FXIIa将PK转化为血浆激肽释放酶，后者通过正反馈进一步激活FXII，并受C1酯酶抑制物调控。Zn²⁺可增强HMWK对带负电细胞表面的亲和力并促进接触因子募集；在内皮细胞上，FXII与HMWK可结合含球状C1q受体（gC1qR）、细胞角蛋白-1（CK1）及尿激酶纤溶酶原激活物受体（uPAR）的Zn²⁺依赖性受体复合物。活化血小板α颗粒和致密颗粒可释放Zn²⁺、polyP及其他促凝介质，形成有利于HMWK表面结合和接触系统组装的局部环境。

2. 激肽释放与炎症信号（Kinin Release and Inflammatory Signalling）
接触系统激活的主要后果之一是HMWK蛋白水解及血管活性肽BK释放。FXIIa激活PK生成血浆激肽释放酶，后者在多个位点裂解HMWK，从D4结构域释放BK并生成裂解型HMWK（HMWKa），构成促进FXII进一步激活和持续激肽生成的正反馈环，从而连接凝血与炎症信号。BK通过两种G蛋白偶联受体发挥作用：组成型表达的缓激肽B2受体（B2R）和诱导型缓激肽B1受体（B1R）。B2R激活介导BK的快速血管作用，包括血管舒张、血管通透性增加和血压调节；B1R在炎症、感染和组织损伤时上调，主要由羧肽酶加工BK生成的des-Arg-BK代谢物激活，且因脱敏有限而参与较持久的炎症反应。BK生成需有序蛋白水解：血浆激肽释放酶先裂解HMWK以分离重链和轻链，再从D4释放BK；轻链内R437-K438后续裂解较慢并生成稳定终产物。血浆激肽释放酶是主要生理性激肽生成酶，但特定实验条件下PK亦可直接化学计量性裂解HMWK并释放BK。替代途径中，凝集素补体途径激活产生MASP-1和MASP-2，二者均可独立于血浆激肽释放酶裂解HMWK，但仅MASP-1产生BK，MASP-2裂解HMWK而不释放BK，提示裂解位点特异性决定激肽生成。纤溶酶亦可直接加工HMWK，遗传性血管性水肿相关Met379Lys变异显著增强纤溶酶介导的BK释放。HMWK裂解还生成具有独立生物活性的HMWKa，其结构重排改变配体与表面结合特性并暴露隐蔽功能区，从而在BK生成之外参与炎症、血管生成和血管调控。

3. 激肽原结构（Structure of Kininogen）
成熟HMWK多肽含626个氨基酸，组织为六个结构域（D1–D6）。D1–D3构成N端重链，D4含BK序列，D5–D6构成C端轻链。HMWK以单链糖蛋白形式循环；血浆激肽释放酶释放BK后生成HMWKa，其重链（D1–D3）与轻链（D5–D6）通过链间二硫键连接，故重链/轻链命名适用于裂解型HMWK而非天然循环蛋白。D5介导与带负电生物表面相互作用，D6含PK和FXI结合位点，使循环PK和FXI主要与HMWK形成复合物，便于在激活表面定位和组装。PK与FXI通过Apple结构域（A1–A4）识别D6内共同31残基片段，但分子机制不同：与PK复合时HMWK肽呈弯曲构象并接触A1和A2；FXI则通过A2和A3识别。这些结构基于重组蛋白片段和合成D6肽而非全长HMWK。D5富含组氨酸，是HMWK主要Zn²⁺结合区；Zn²⁺结合增强HMWK对内皮细胞等带负电表面的亲和力并促进PK、FXI和FXII组装。D5至少含两个阴离子表面结合区：富含组氨酸区和更C端的富含组氨酸/赖氨酸区，后者共同形成Zn²⁺调控的多价相互作用平台。D5高分辨率结构尚缺，因其富含组氨酸、低复杂度而可能高度灵活；其与富含组氨酸糖蛋白（HRG）的富含组氨酸区（HRR）有结构和功能相似性，但序列组织不同。基于Cu²⁺替代Zn²⁺的电子顺磁共振分析提示HRG HRR无单一明确金属结合位点，而由多个组氨酸簇协调金属离子；HMWK D5可能亦呈动态结合机制。重组HK5生物物理研究显示其以无规卷曲为主，Zn²⁺未诱导显著无序-有序转变，而可能改变局部构象偏好、静电性质和相互作用动力学。D5与铁蛋白、肝素、糖胺聚糖、gC1qR、内皮受体及细胞外基质等配体相互作用的结构后果多不明确。HMWK经血浆激肽释放酶裂解生成HMWKa时伴显著构象重排，增加D5可及性并增强其与阴离子表面相互作用，可能贡献抗黏附特性；同时BK作用于内皮细胞促进血管舒张和通透性。

4. Zn²⁺依赖性调控接触激活（Zn²⁺-Dependent Regulation of Contact Activation）
Zn²⁺是HMWK功能和接触系统组装的重要调节因子。Zn²⁺结合增强HMWK与多种阴离子表面相互作用，包括细胞表面、细胞外糖胺聚糖、细胞外基质组分、polyP及β-淀粉样蛋白（Aβ）等蛋白聚集体，从而促进HMWK及相关接触因子在接触激活部位定位。polyP是强效接触途径激活物，并以链长依赖方式加速多种接触激活反应；活化血小板同时释放polyP和Zn²⁺，可显著影响血栓形成中的接触系统活性。不同接触途径反应对Zn²⁺和HMWK的需求不同：FXII作为底物的反应需要Zn²⁺，而血浆激肽释放酶介导的反应最需要HMWK；血浆激肽释放酶需HMWK才能有效结合含polyP表面。HMWK对某些FXIIa催化反应并非必需，但仍可能影响动力学和效率；高浓度（≥500 nM）HMWK可抑制polyP驱动的接触激活，可能通过与FXII或FXIIa竞争polyP结合位点。胶原、polyP、错误折叠蛋白和高岭土等激活表面负电荷密集，可静电吸引Zn²⁺并在表面-血浆界面形成局部高金属离子浓度；无Zn²⁺时HMWK对许多激活表面亲和力较低。Zn²⁺结合被认为改变D5构象和静电性质，增强HMWK与负电表面结合并募集接触因子，使HMWK作为Zn²⁺响应性分子支架集中接触系统组分。金属螯合研究显示，EDTA抑制polyP存在下FXIIa介导的PK激活；提高polyP浓度可部分补偿该抑制，提示表面可用性增加可减弱Zn²⁺依赖性相互作用缺失的影响。

5. 细胞锚定、多蛋白受体与锌调控（Cellular Anchorage, Multi-Protein Receptors, and Zinc Modulation）
除激活表面外，Zn²⁺为HMWK有效结合内皮细胞、血小板和白细胞所必需。广泛接受的模型认为HMWK结合含gC1qR、CK1和uPAR的多蛋白受体复合物，促进接触系统在细胞表面定位，但其体内发生程度和生理重要性仍未完全明确。gC1qR被认为是HMWK和HMWKa的主要高亲和力结合位点，CK1参与组装和稳定细胞表面受体复合物，uPAR主要参与下游信号并介导HMWKa生物活性；Zn²⁺为HMWKa有效结合uPAR及部分抗血管生成效应所必需。近期研究显示D5介导高亲和力gC1qR结合并促进接触系统组分在细胞表面定位；D5内多个配体结合区提示其可通过多价接触与gC1qR结合，结构及突变研究支持gC1qR簇集HMWK和其他接触因子，但D5-gC1qR识别精确结构基础及D5亚区贡献仍不清楚。HMWK和HMWKa对内皮细胞总体亲和力为纳摩尔级（K_d≈7–52 nM），但各形式对总细胞结合贡献不明。表面等离子共振研究使用可溶性uPAR（suPAR）、gC1qR和CK1胞外形式显示所有相互作用严格依赖Zn²⁺，亲和力顺序为gC1qR>CK1>suPAR；HMWK与HMWKa对gC1qR亲和力相似，而HMWKa对CK1亲和力高约2.6倍、对suPAR高约53倍。受体-受体相互作用仅见于gC1qR与CK1，提示gC1qR-CK1二元复合物可独立于激肽原组装。suPAR总体亲和力最弱，但唯一能明显区分HMWK与HMWKa，提示uPAR可能介导二者细胞识别和信号差异；gC1qR和CK1更可能作为锚定分子，在HMWKa生成前募集和浓集HMWK。

6. 临床背景：锌稳态改变与病理生理（Clinical Context: Altered Zinc Homeostasis and Pathophysiology）
HMWK生物活性受Zn²⁺可利用性强烈影响，锌稳态紊乱可能改变接触系统激活、激肽生成、血管通透性和炎症反应；Zn²⁺在人类疾病中对HMWK功能的精确贡献仍未完全明确。
6.1 激肽原缺乏与自然发生的KNG1变异（Kininogen Deficiency and Naturally Occurring KNG1 Variants）
KNG1基因自然失功能变异为了解HMWK和接触系统生理功能提供线索。严重HMWK缺乏者通常活化部分凝血活酶时间显著延长，反映HMWK在接触途径激活和内源性凝血试验中的重要作用；但多数报道个体无明显出血倾向，提示HMWK对正常止血大体非必需。近期研究扩展了致病KNG1变异谱并分析严重HMWK缺乏者的临床和实验室特征；这些变异可能通过损害蛋白合成、分泌、血浆稳定性或接触系统组装所需功能相互作用致病。尽管体外接触激活显著受损，严重HMWK缺乏相关临床表型相对轻微，提示HMWK依赖性接触激活对正常止血的重要性可能低于凝血试验异常所提示者，也支持以接触途径为靶向且尽量降低出血风险的治疗策略。严重KNG1缺乏对Zn²⁺依赖性HMWK相互作用的影响尚不清楚。
6.2 糖尿病、锌形态与接触系统激活（Diabetes, Zinc Speciation and Contact System Activation）
肥胖和2型糖尿病（T2D）等心脏代谢疾病以慢性低度炎症、内皮功能障碍及动静脉血栓风险增加为特征，血浆锌处理失调可能通过改变凝血和血管生物学中Zn²⁺依赖性蛋白活性参与其病理。正常情况下约75%血浆Zn²⁺与血清白蛋白结合，白蛋白是循环中可交换锌的主要缓冲和转运体；其Zn²⁺结合能力受循环非酯化脂肪酸（NEFA）调控。长链脂肪酸结合白蛋白高亲和力FA2位点诱导变构构象变化，破坏主要Zn²⁺结合位点（site A），降低白蛋白对Zn²⁺亲和力并增加血浆可交换金属离子，此即白蛋白-脂肪酸-锌转换，连接脂代谢与细胞外锌形态。肥胖、胰岛素抵抗和T2D中NEFA常升高，提示白蛋白介导的锌缓冲扰动可能是共同特征。可交换Zn²⁺增加可改变HRG、纤维蛋白原和HMWK等多种凝血蛋白活性；虽然直接研究有限，但Zn²⁺增强HMWK与阴离子表面结合并促进接触系统组装，提示锌形态改变可能影响接触激活阈值。该模型因HMWK作为接触途径Zn²⁺响应性支架而具吸引力：Zn²⁺可利用性增加可能促进HMWK与负电表面相互作用、HMWK-PK-FXI复合物组装及接触因子在血管损伤或炎症部位定位。过量激肽释放酶-激肽信号与血管功能障碍和慢性炎症相关；BK调节内皮通透性、血管张力和炎症细胞募集，FXII和血浆激肽释放酶激活亦可独立于激肽生成放大炎症信号。尽管缺乏白蛋白-脂肪酸-锌转换在体内增强HMWK激活的直接证据，但高NEFA与促血栓止血改变相关，锌形态改变可重新分配血浆蛋白间Zn²⁺并增加其与候选结合伙伴关联。
6.3 COVID-19与炎症（COVID-19 and Inflammation）
住院COVID-19患者尤其重症者可见低锌血症，较低血浆锌与较差临床结局和炎症标志物升高相关。Zn²⁺对先天和适应性免疫均必需；锌缺乏损害淋巴细胞尤其T细胞增殖、分化和存活，并可能促成淋巴细胞减少和适应性免疫受损。Zn²⁺亦调节中性粒细胞激活和炎症信号，锌缺乏时中性粒细胞功能可失调并与中性粒细胞/淋巴细胞比值升高相关。锌缺乏后果不限于白细胞功能障碍，Zn²⁺还调节包括HMWK和接触系统其他组分在内的多种凝血与炎症血浆蛋白。尽管多数研究聚焦免疫功能障碍，过量激肽释放酶-激肽信号和BK生成被认为参与重症COVID-19血管渗漏、肺部炎症和内皮功能障碍；鉴于Zn²⁺调控HMWK定位和接触激活，锌稳态紊乱可能通过免疫和血管途径影响炎症反应。
6.4 淀粉样变性疾病与神经炎症（Amyloidosis Disorders and Neuroinflammation）
淀粉样疾病相关蛋白聚集体可提供异常负电表面，募集并激活激肽释放酶-激肽系统。聚集Aβ是最具代表性例子，可以Zn²⁺依赖方式激活血浆激肽形成级联；HMWK D5通过Zn²⁺依赖性相互作用介导与淀粉样组装体结合，促进接触系统组分在蛋白聚集部位募集和组织。Zn²⁺还促进Aβ肽聚集，增加支持接触激活的表面可用性，并增强HMWK和FXII与聚集Aβ关联，促进接触途径激活及BK生成。Zn²⁺与淀粉样病理的相互作用复杂且依赖情境；可溶性寡聚Aβ被认为是淀粉样相关毒性和炎症的重要介质，Zn²⁺通过结合Aβ组氨酸残基影响Aβ组装行为、结构组织和生物活性。除阿尔茨海默病外，接触系统激活可能参与更广泛神经和脑血管疾病；FXII激活、血浆激肽释放酶及下游信号与缺血性卒中相关，可能促进神经炎症、血脑屏障功能障碍和脑水肿，类似机制可能参与血管性痴呆和血管性认知障碍。HMWK具体贡献仍不明确，且将Zn²⁺依赖性HMWK功能与血管性认知障碍等神经退行性疾病联系起来的直接证据有限。
6.5 血管生成调控（Angiogenic Regulation）
激肽原系统可生成促血管生成和抗血管生成介质。BK通过B1和B2受体及血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子相关信号促进血管生成；相反，HMWK蛋白水解生成HMWKa，后者为强效内源性血管生成抑制剂，通过破坏内皮黏附、抑制细胞周期、干扰促存活信号和诱导凋亡等多机制抑制血管生成。D5内富含组氨酸和甘氨酸序列（残基441–457和475–502）选择性破坏内皮细胞与玻连蛋白和明胶黏附，导致脱离诱导凋亡；HMWKa还通过多种信号机制抑制内皮增殖并促进凋亡。D5与uPAR的D2/D3结构域相互作用产生额外抗血管生成活性，破坏玻连蛋白-uPAR-α_vβ₃-caveolin-Src-FAK-paxillin信号轴。HMWKa以Zn²⁺依赖方式结合内皮细胞原肌球蛋白，HRG来源富含组氨酸-脯氨酸肽研究提示金属离子结合和溶液条件可调节这些相互作用；活化血小板局部释放Zn²⁺可能增强这些效应并强化HMWKa抗血管生成特性。

7. 未来展望（Future Perspectives）
尽管研究数十年，Zn²⁺调控HMWK和接触系统仍存重要问题。接触途径生化组织和HMWK、FXII、FXI、PK间相互作用已有进展，但接触激活分子机制许多方面仍不清楚。主要未解问题为HMWK结构生物学：虽已知其为多功能六结构域蛋白并兼具辅因子和BK生成底物功能，但完整蛋白高分辨率三维结构尚缺，Zn²⁺结合、接触因子识别和表面结合的结构基础仍不明确；对内在无序D5构象组织及Zn²⁺结合如何影响其与阴离子表面和细胞受体相互作用知之甚少。HMWK向HMWKa转化后的结构重排分子细节亦未解决。第二挑战是理解生理和病理条件下接触激活如何启动；经典模型依赖高岭土等人工表面，体内内源性激活物身份和相对重要性仍不确定，polyP、错误折叠蛋白和淀粉样聚集体均被提出为生理相关激活物。新证据提示锌形态而非总血浆锌浓度可能是接触系统活性关键决定因素；白蛋白-脂肪酸-锌转换揭示代谢改变如何调节血浆可交换Zn²⁺可用性。鉴于HMWK表面结合、受体相互作用和接触因子组装强烈依赖Zn²⁺，明确细胞外锌形态变化如何影响HMWK功能是重要优先事项。未来需先进结构和生物物理方法定义HMWK及其复合物架构，并开发测量生物体液中锌形态和不稳定Zn²⁺池的新方法。转化方面，靶向Zn²⁺依赖性接触系统调控具治疗潜力；当前策略多抑制FXII、血浆激肽释放酶或BK受体等单个组分，调节Zn²⁺可用性、破坏Zn²⁺依赖性HMWK相互作用或操纵细胞外锌形态可能提供控制接触系统驱动炎症和血栓的替代策略。

8. 结论（Conclusions）
HMWK位于凝血、炎症和血管生物学交汇处。除作为BK前体外，其作为多功能支架通过FXII、FXI和血浆激肽释放酶相互作用协调接触系统组装。越来越多证据表明这些相互作用许多受Zn²⁺强烈影响，尤其通过富含组氨酸D5结构域调控与细胞受体、激活表面和接触途径蛋白结合，因此Zn²⁺可用性成为接触激活及下游炎症信号的重要决定因素。尽管HMWK生化和细胞功能已有进展，Zn²⁺结合分子基础、完整蛋白结构组织和体内接触激活机制仍存疑问。白蛋白-脂肪酸-锌转换等新兴概念提示锌形态而非总锌浓度可能对健康和疾病中HMWK功能具重要影响。理解细胞外Zn²⁺可用性动态变化如何影响接触系统激活，可能为血栓形成、炎症和血管功能障碍发病机制提供新见解，并识别新的治疗干预机会。