TFA通过抑制NFATc1信号轴缓解骨质疏松：黄蜀葵花总黄酮的抗破骨细胞作用与转录组学机制研究

《Pharmaceuticals》：Safety, Tolerability, Pharmacokinetics, and Immunogenicity of BXOS110, a Novel PSD-95 Inhibitor: A First-in-Human Trial

背景：骨质疏松症（Osteoporosis）是一种以破骨细胞介导的骨吸收过度和进行性骨丢失为特征的系统性骨骼疾病。目前抗骨质疏松药物的临床应用常因不良反应而受限，亟需开发更安全有效的治疗策略。黄蜀葵花总黄酮（Total flavonoids of Abelmoschus manihot，TFA）具有强效的抗炎和肾脏保护活性，但其在骨质疏松中的作用尚不明确。本研究旨在探讨TFA对骨质疏松的保护作用，并阐明其在破骨细胞生成中的潜在机制。方法：在体内实验中，研究人员评估了去卵巢（ovariectomy，OVX）大鼠经TFA治疗后骨矿物质密度（bone mineral density，BMD）、骨组织形态学、生物力学特性及血清生化指标的变化。在体外实验中，研究人员在核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）刺激的骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages，BMDMs）中检测了破骨细胞分化、肌动蛋白环形成、骨吸收能力及破骨细胞相关基因表达。研究人员采用转录组测序以鉴定TFA调控的关键基因和通路。结果：TFA显著减轻了OVX诱导的骨丢失，改善了骨微结构和生物力学性能，并恢复了血清骨转换标志物水平。在体外，TFA在不影响细胞活力的前提下显著抑制了RANKL诱导的破骨细胞形成、肌动蛋白环组装和骨吸收活性。机制上，TFA抑制了破骨细胞生成主转录因子Nfatc1及其下游基因（包括Acp5、Ctsk、Mmp9和Atp6v0d2）的表达。转录组分析显示，TFA协调调控了与单核细胞定向和早期破骨细胞分化相关的多个基因。结论：TFA通过抑制Nfatc1信号轴并重编程调控破骨细胞生成的转录网络，从而保护机体免受病理性骨丢失的影响。这些发现表明TFA是预防和治疗骨质疏松症的一种有前景的治疗候选药物。

一、研究背景与意义

骨质疏松症（Osteoporosis，OP）是一种以骨量减少和骨微结构退化为特征的系统性骨骼疾病，最终导致骨强度下降和骨折风险增加。全球约21.7%的老年人受OP影响，骨质疏松性骨折给社会和经济带来沉重负担。仅美国每年就有超过200万例脆性骨折发生，50岁以上女性终生骨折风险接近50%，男性约为25%。髋部骨折尤为严重，与高死亡率、丧失独立生活能力和复发性骨折密切相关。当前治疗策略主要包括抗骨吸收药物如双膦酸盐和地诺单抗（denosumab），以及合成代谢疗法如特立帕肽和激素替代治疗。然而，这些药物的长期应用受到不良反应的限制，包括颌骨坏死、心血管并发症、肾脏损害以及乳腺癌和卵巢癌风险增加，凸显了开发更安全有效干预措施的迫切性。

骨稳态依赖于破骨细胞、成骨细胞和骨细胞在持续重塑过程中的协调活动。绝经后骨质疏松主要以破骨细胞介导的骨吸收超过骨形成为特征。破骨细胞生成由巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）和核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）启动，二者促进破骨细胞前体的存活、增殖和分化。在众多下游转录调控因子中，活化T细胞核因子1（nuclear factor of activated T cells 1，NFATc1）是破骨细胞分化的主调控因子，对破骨细胞生成既必要又充分。活化的破骨细胞表达一系列特征性标志物，包括抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP，Acp5）、组织蛋白酶K（cathepsin K，Cat K，Ctsk）、基质金属蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP-9）和树突状细胞特异性跨膜蛋白（dendritic cell-specific transmembrane protein，DC-STAMP），这些分子共同介导骨吸收和多核破骨细胞形成。

黄蜀葵花（Abelmoschus manihot (L.) Medic）是一种具有重要药用和营养价值的传统草药。基于其在慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）中的临床疗效，黄蜀葵花乙醇提取物被开发为黄葵胶囊（Huangkui Capsules，HKCs），在中国获批用于治疗慢性肾炎，现广泛用于肾炎和类风湿关节炎。药理学研究表明，黄酮类化合物是HKCs的主要生物活性成分，具有肾脏保护、抗炎和抗纤维化活性，部分通过抑制TRPC6/CnA/NFAT信号通路实现。TFA在肾细胞中抑制TRPC6/CnA/NFAT信号通路与骨骼具有机制相关性，因为NFATc1是破骨细胞生成中的主转录因子。中医"肾主骨"理论认为肾精对骨骼营养和完整性至关重要，肾虚被视为绝经后骨质疏松的基本致病因素。现代医学证据进一步支持肾-骨轴涉及维生素D代谢、钙磷稳态、内分泌调节以及骨保护素（Osteoprotegerin，OPG）/RANKL/RANK信号通路。

黄酮类化合物作为一类化合物具有公认的抗破骨细胞生成活性，TFA中存在的金丝桃苷（hyperoside）、异槲皮苷（isoquercitrin）、槲皮素（quercetin）和杨梅素（myricetin）均对破骨细胞分化和骨吸收具有直接抑制作用。基于补肾中药对骨质疏松的治疗效果以及黄蜀葵花的肾脏保护特性，研究人员假设黄蜀葵花总黄酮（Total flavonoids of Abelmoschus manihot (L.) Medic，TFA）可能对骨质疏松发挥有益作用。然而，TFA是否能改善去卵巢（ovariectomy，OVX）诱导的骨丢失及其潜在机制仍不清楚。

二、主要技术方法

本研究采用多层面实验体系。体内实验使用8月龄雌性Sprague-Dawley大鼠（450±50 g，购自江苏青龙山生物科技有限公司），随机分为6组（每组6只）：假手术对照组（Con）、OVX溶剂模型组、阳性对照组（阿仑膦酸钠6.25 mg/kg/周+维生素D₃ 250 IU/kg/周）以及TFA低（30 mg/kg/天）、中（60 mg/kg/天）、高（120 mg/kg/天）剂量组，连续灌胃12周。采用micro-CT检测骨矿物质密度（bone mineral density，BMD），三点弯曲试验评估生物力学性能，H&E染色观察骨组织形态学，ELISA检测血清TRAP、骨钙素（osteocalcin，OC）和骨碱性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，BALP）水平。体外实验从小鼠骨髓中分离BMDMs，以M-CSF和RANKL诱导破骨细胞分化，采用TRAP染色、F-actin荧光染色和骨片吸收实验评估破骨细胞形成与功能，MTT法检测细胞活力，qRT-PCR检测基因表达，并采用bulk RNA测序进行转录组分析。

三、研究结果

3.1 TFA减轻OVX诱导的骨丢失

H&E染色显示，Con组骨髓腔较小，骨小梁厚实、排列整齐且完整；OVX+Veh组骨髓腔显著扩大，空泡化明显，骨小梁稀疏紊乱且连接性降低。ALN+VD₃或30、60、120 mg/kg TFA治疗部分逆转了这些改变。micro-CT分析显示，OVX使BMD从对照组的0.61±0.003 g/cm³降至0.49±0.03 g/cm³（p<0.01），而ALN+VD₃和60、120 mg/kg TFA分别将其恢复至0.58±0.02、0.59±0.04和0.58±0.02 g/cm³（均p<0.05）。生物力学测试中，OVX使杨氏模量从5786±587.5 MPa降至3269±269.7 MPa（p<0.05），ALN+VD₃和60 mg/kg TFA分别将其恢复至6464±404.5 MPa（p<0.01）和6844±1080 MPa（p<0.01）；弯曲应力也从236.7±13.06 MPa降至173.2±13.84 MPa（p<0.05），ALN+VD₃和60 mg/kg TFA分别将其提高至256.0±12.03 MPa（p<0.01）和236.4±14.17 MPa（p<0.01）。

3.2 TFA改善OVX诱导的血清生化指标改变

OVX大鼠血清TRAP水平较Con组显著升高（99.74±2.81 pg/mL vs. 86.98±1.03 pg/mL，p<0.01），ALN+VD₃和60 mg/kg TFA分别将其降至88.58±3.36 pg/mL（p<0.05）和80.40±3.13 pg/mL（p<0.01）。血清OC水平在OVX后显著降低（10,697±531.3 pg/mL vs. 13,853±1002 pg/mL，p<0.05），ALN+VD₃和30 mg/kg TFA分别将其提高至15,138±837.5 pg/mL（p<0.01）和15,534±1055 pg/mL（p<0.01）。OVX使血清BALP水平显著升高（1316±30.26 pg/mL vs. 1145±29.83 pg/mL，p<0.01），ALN+VD₃及30、60、120 mg/kg TFA分别将其降至1146±37.23、1011±23.44、845.9±40.18和892.2±27.94 pg/mL（均p<0.01）。

3.3 TFA抑制RANKL诱导的破骨细胞生成和肌动蛋白环形成

MTT实验表明，1、3、5 μg/mL TFA处理24 h不影响BMDM活力。M-CSF和RANKL刺激显著促进破骨细胞分化，TRAP阳性细胞比例从Veh组的0.00±0.00%增至100.00±9.28%（p<0.01），3和5 μg/mL TFA分别将其降至72.58±3.35%（p<0.05）和71.74±6.67%（p<0.01）。5 μg/mL TFA还显著减小TRAP阳性细胞面积至78.43±3.99%（p<0.05）。肌动蛋白环分析显示，5 μg/mL TFA将肌动蛋白环形成破骨细胞数量从100.00±6.86%降至46.81±12.20%（p<0.01），3和5 μg/mL TFA分别将肌动蛋白环面积降至67.50±8.88%（p<0.01）和47.34±7.69%（p<0.01）。

3.4 TFA损害RANKL刺激的破骨细胞骨吸收功能

扫描电镜显示，Veh+RANKL组骨片上可见广泛的吸收陷窝，3和5 μg/mL TFA分别将吸收陷窝面积降至42.78±5.62%（p<0.01）和46.95±4.06%（p<0.01），表明TFA显著抑制破骨细胞骨吸收活性。

3.5 TFA抑制RANKL诱导的破骨细胞相关基因表达

5 μg/mL TFA将Nfatc1表达从1.88±0.14倍降至1.14±0.15倍（p<0.01），Acp5从297.8±49.92倍降至139.4±16.44倍（p<0.01），Ctsk从3063±269.6倍降至1533±186.6倍（p<0.01），Mmp9从1454±215.9倍降至586.8±136.4倍（p<0.01），Atp6v0d2从25.84±3.33倍降至14.89±0.99倍（p<0.01）。Oc-stamp和Dc-stamp的表达虽有下降趋势但未达统计学显著。

3.6 TFA逆转RANKL诱导的S100a8/S100a9和单核细胞相关基因上调

转录组测序显示，RANKL刺激导致1297个基因上调和1323个基因下调；TFA处理相对于M-CSF+RANKL组有133个基因显著上调和224个基因显著下调。qRT-PCR验证表明，TFA显著降低RANKL诱导的S100a8（从5.84±1.37倍降至2.44±0.45倍，p<0.05）、S100a9（从6.85±1.90倍降至2.27±0.39倍，p<0.05）、Prtn3（从3.77±0.76倍降至1.19±0.16倍，p<0.05）、Lcn2（从8.72±2.21倍降至2.70±0.28倍，p<0.01）、Camp（从16.21±5.69倍降至2.02±0.98倍，p<0.05）、Ctsg（从3.70±0.42倍降至1.31±0.44倍，p<0.01）、Ly6c2（从3.47±0.48倍降至1.39±0.37倍，p<0.05）、Ngp（从2.09±0.07倍降至0.83±0.31倍，p<0.01）、Tesc（从2.65±0.76倍降至0.90±0.11倍，p<0.05）和Exosc6（从1.64±0.18倍降至0.99±0.13倍，p<0.01）的表达。

四、讨论与结论

讨论部分指出，骨质疏松以骨重塑失衡为特征，现有抗骨吸收和合成代谢药物虽降低骨折风险，但长期使用伴随多种不良反应。组织蛋白酶K抑制剂odanacatib和balicatib虽显示抗骨质疏松疗效，但因严重脱靶毒性被终止，凸显了开发更安全治疗策略的必要性。中医理论认为肾精生髓养骨，肾阴虚是骨质疏松的根本原因，补肾中药常对骨质疏松有益。本研究中TFA显著降低OVX诱导升高的血清TRAP和BALP，并恢复OC水平，表明TFA通过抑制过度破骨细胞介导的骨吸收同时促进更平衡的骨重塑来维持骨骼完整性。TFA处理呈现剂量非依赖性趋势，60 mg/kg剂量效果最明显，可能反映提取物成分间的协同或拮抗作用、次要成分的脱靶效应或肠道吸收饱和。机制上，TFA通过抑制Nfatc1及其下游基因Acp5、Ctsk、Mmp9和Atp6v0d2来抑制破骨细胞生成。S100A8/A9异二聚体（钙卫蛋白）作为炎症性疾病中富集的损伤相关分子模式蛋白，可通过正反馈环路放大RANKL信号促进破骨细胞分化和骨侵蚀，TFA逆转RANKL诱导的S100a8/S100a9上调可能有助于减弱破骨细胞生成。TFA还调控一系列单核细胞相关和早期分化相关基因。研究局限性包括未进行NFATc1功能获得/缺失实验建立因果关系、TFA约40%成分未表征、剂量非依赖性效应需进一步药代动力学研究。

结论部分：总体而言，研究结果表明TFA通过抑制NFATc1信号轴并重塑单核细胞定向和破骨细胞分化的转录景观来减轻病理性骨丢失，从而凸显其作为骨质疏松症治疗候选药物的潜力。一个重要局限性是NFATc1作为TFA直接靶点的因果证据尚未建立，未来研究应聚焦于NFATc1功能获得和缺失实验以确立因果关系。