《Cancers》：Tumour Cell-Associated Heterogeneity in Antiviral Immunity Shapes Influenza Responses and Immune-Modulatory Signalling in Lung Cancer
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背景/目的：呼吸道病毒感染与肺癌发生于相同的解剖学部位，然而肺癌细胞如何应对感染以及这些应答如何影响抗病毒和炎症信号通路仍知之甚少。本研究调查了在一组肺上皮细胞系中针对甲型流感病毒（IAV）的先天免疫应答。方法：研究人员用IAV感染了非恶性支气管上皮细胞和代表
背景/目的：呼吸道病毒感染与肺癌发生于相同的解剖学部位，然而肺癌细胞如何应对感染以及这些应答如何影响抗病毒和炎症信号通路仍知之甚少。本研究调查了在一组肺上皮细胞系中针对甲型流感病毒（IAV）的先天免疫应答。方法：研究人员用IAV感染了非恶性支气管上皮细胞和代表腺癌及鳞状细胞癌的非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系。采用分子、生化和流式细胞术方法评估了抗病毒和炎症基因表达、病毒RNA和蛋白检测、感染诱导的细胞死亡、模式识别受体（PRR）表达以及免疫检查点配体表达。使用干扰素（IFN）受体阻断和线粒体活性氧清除来探究特定的信号传导机制。结果：NSCLC细胞系对IAV感染表现出异质性的先天免疫应答，在RNA感应通路和经典抗病毒信号组分的调控方面存在差异。尽管保留了IFN应答，但与正常上皮细胞相比，NSCLC细胞表现出感染诱导的凋亡减少以及病毒RNA和蛋白的持续检出时间延长。IAV感染还与DNA感应受体（包括TLR9）的表达变化以及免疫检查点配体PD-L1的表达增加相关。结论：这些发现揭示了肺上皮细胞系（包括NSCLC细胞）对IAV的抗病毒应答存在显著的细胞系相关性异质性。所观察到的病毒RNA和蛋白检测、细胞死亡应答以及免疫调节信号的差异，为理解呼吸道病毒感染如何与肺癌细胞相互作用从而塑造肿瘤微环境中的抗病毒和炎症应答提供了框架。
研究背景与科学问题
肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因，其中非小细胞肺癌约占85%。肺癌起源于呼吸道上皮细胞，这使得肿瘤细胞恰好位于呼吸道病毒感染的原始位点。因此，恶性上皮细胞不仅暴露于病原体，还可能成为病毒感染的潜在靶点。虽然呼吸道病毒感染已被公认可通过影响免疫微环境来调控肿瘤进展，但感染对肿瘤细胞本身的直接影响仍不明确。甲型流感病毒是一种单链RNA病毒，其在上皮细胞内的识别由模式识别受体介导，这些受体激活下游信号通路导致I型和III型干扰素的产生及抗病毒效应应答的诱导。然而，许多相同的信号网络在NSCLC中是失调的。例如，TLR信号在肺癌中具有双重功能，肿瘤内在的TLR信号与增强存活、化疗耐药和转移潜能相关。这些改变提出了一个问题：肿瘤细胞中的抗病毒应答可能在功能上发生改变，不仅影响病毒的感知方式，也影响感染被控制的有效程度。新兴证据表明，呼吸道病毒感染可以调节肺部肿瘤的进展，其结果取决于感染时机、肿瘤分期和免疫环境。然而，大部分现有证据集中于病毒诱导的肿瘤微环境变化，特别是巨噬细胞和T细胞的应答，而对于恶性上皮细胞本身如何识别和响应呼吸道病毒感染知之甚少。研究人员假设肺癌细胞对IAV感染表现出独特的肿瘤细胞内在抗病毒应答，这可能创造一个具有不同病毒控制和下游免疫信号能力的细胞内环境。
研究方法概述
研究人员使用了一组肺上皮细胞系，包括非恶性支气管上皮细胞BEAS-2B，肺腺癌细胞系A549和CALU-3，以及肺鳞癌细胞系H520和SK-MES-1。主要技术方法包括：使用IAV的PR8 H1N1毒株进行体外感染实验；采用碘化丙啶摄取实验和Caspase-3/7活性测定法评估感染诱导的细胞死亡；利用RT-qPCR定量分析抗病毒和炎症基因表达、病毒转录本以及PRR和免疫检查点分子的mRNA水平；通过Western blot检测PRR、衔接蛋白和病毒核蛋白的表达；使用流式细胞术检测细胞表面PD-L1的表达；采用荧光显微镜结合PicoGreen染色观察胞内DNA积累；并使用IFNAR1抗体阻断和mitoTEMPO清除线粒体活性氧来探究特定信号机制。
主要研究结果
3.1 IAV感染在NSCLC细胞系中诱导不同水平的凋亡性细胞死亡
通过PI摄取实验和PARP切割及DEVDase活性检测发现，非恶性BEAS-2B细胞呈现剂量和时间依赖性的细胞死亡增加及凋亡标志物活化。相比之下，大多数NSCLC细胞系（A549、CALU-3、H520）未显示明显的感染诱导细胞死亡，仅SK-MES-1在高剂量下略有增加。这表明恶性肺上皮细胞系在所用实验条件下表现出极小的感染相关凋亡反应。
3.2 NSCLC细胞系在IAV感染后表现出可变的抗病毒细胞因子应答
RT-qPCR结果显示，IL6在不同细胞系中诱导情况各异，而TNF在所有细胞系中均显著上调。I型和III型IFN在多数细胞中被诱导，但A549细胞缺乏可检测的IFNL2/3表达。病毒PA转录本在所有细胞系中以剂量依赖性方式被检出，确认感染成功。Western blot显示NSCLC细胞系中病毒NP蛋白随时间累积增加，而在BEAS-2B细胞中保持稳定。长期培养实验发现，感染后第3天和第7天，A549细胞中病毒转录本显著高于BEAS-2B细胞，而IFNB在BEAS-2B中维持更高水平。
3.3 NSCLC细胞系展示异质性的基础PRR蛋白表达和信号应答
Western blot分析揭示了各细胞系间PRR及衔接蛋白的基础表达谱存在显著差异。TLR3在各细胞系中表达相当，但其衔接蛋白TRIF在A549和SK-MES-1中低表达。TLR7在BEAS-2B和A549中表达，在H520中缺失。TLR9在CALU-3和H520中表达。RIG-I在A549和CALU-3中明显，在H520中无法检测。功能性激动剂实验表明，尽管A549表达TLR7蛋白，但TLR7激动剂IMQ未能诱导其TNF上调，显示了受体表达与下游信号之间的脱节。
3.4 IAV在NSCLC细胞系中诱导抗病毒感应通路的异质性调控
IAV感染后，RNA感应受体的调控不一致。TLR3在部分细胞中上调，在A549和H520中下调。TLR7在多个细胞系中上调，在H520中始终无法检测。DDX58除H520外在所有细胞中上调。相反，DNA感应受体TLR9在所有细胞系中一致性地显著上调，cGAS也在多数细胞中上调。这揭示了在可变RNA感应应答背景下，保守的应激相关DNA感应基因的诱导。
3.5 IAV相关的PRR调控涉及IFNAR1依赖性和非依赖性机制
在BEAS-2B细胞中，IFNAR1阻断消除了感染介导的TLR3和DDX58上调，但不影响TLR9的诱导，表明RNA传感器受IFN依赖调控，而TLR9受IFN非依赖机制调控。在A549细胞中也观察到类似结果。使用mitoTEMPO清除线粒体ROS可部分减弱TLR9的上调而不影响TLR3。此外，IAV感染增加了胞浆DNA的积累。这些发现表明TLR9的调控涉及IFN非依赖的、与线粒体应激相关的途径。
3.6 IAV相关的I型IFN信号促进肺上皮细胞中免疫检查点的上调
转录分析显示，除H520外，所有细胞系的PDL1在感染后均显著上调。PDL2呈现相似模式。流式细胞术证实BEAS-2B、CALU-3和SK-MES-1细胞表面PD-L1显著增加。A549虽早期无表面增加，但在感染后第3天PDL1转录本显著升高。IFNAR1阻断显著减少了BEAS-2B中PDL1的上调以及BEAS-2B、CALU-3和SK-MES-1中表面PD-L1的表达，表明I型IFN信号是急性IAV相关PD-L1上调的主要驱动因素。
讨论与结论总结
讨论部分指出，NSCLC细胞保留了启动IFN信号的能力，但这些应答与病毒蛋白积累及免疫调节和细胞存活相关下游通路的诱导相关联。I型IFN信号促进了PD-L1的上调，将抗病毒应答与肿瘤免疫检查点表型联系起来，并在非恶性上皮细胞中参与了感染诱导的凋亡信号。相反，NSCLC细胞对急性IAV诱导的细胞死亡表现出相对抵抗。这些发现强调了NSCLC对IAV应答的细胞系相关性异质性，涵盖抗病毒信号、细胞死亡易感性和免疫调节应答。这种变异性支持了恶性转化可能重塑肿瘤细胞内在的抗病毒应答的概念，差异性影响病毒限制、细胞存活和炎症信号，并对病毒感染后的肿瘤免疫格局产生潜在后果。研究还提出，NSCLC细胞中观察到的对IAV诱导细胞死亡的抵抗可能延长感染细胞的存活，从而延长感染相关信号，可能支持病毒持续存在和促肿瘤炎症状态。同时，RNA和DNA感应通路在感染期间表现出差异性调控，其中RNA传感器受IFN依赖调控，而DNA传感器如TLR9则通过线粒体ROS相关的IFN非依赖机制被诱导。
研究结论部分翻译如下：
我们的发现证明了肺上皮细胞对IAV的肿瘤细胞内在应答存在显著异质性，将呼吸道病毒感染与NSCLC细胞中抗病毒信号、细胞死亡和免疫调节通路的差异性调控联系起来。抗病毒信号的保留，连同对感染诱导细胞死亡的易感性降低以及PD-L1表达的增加，表明肿瘤细胞内在应答可能影响感染后病毒限制、炎症信号和免疫调节之间的平衡。从转化角度而言，这些发现为研究肿瘤抗病毒和存活反应的差异如何促成呼吸道病毒感染对癌症进展的情境依赖性效应奠定了基础。需要使用生理相关模型和体内肿瘤系统进行进一步的机制研究，以确定这些应答的功能后果及其与肿瘤-免疫相互作用和临床结局的相关性。
