《Macromol》：Ficin-Modified Chitosan Hydrogels: In Vitro Hemocompatibility and Hemostatic Performance
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出血仍然是创伤和手术中导致死亡的主要原因，这推动了人们对有效局部止血材料的探索。壳聚糖因其生物相容性、生物可降解性和内在止血活性而成为一种有前景的候选材料，然而壳聚糖水凝胶在血液相容性方面的表征仍然不足。本研究评估了具有不同交联度的壳聚糖水凝胶及其
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出血仍然是创伤和手术中导致死亡的主要原因，这推动了人们对有效局部止血材料的探索。壳聚糖因其生物相容性、生物可降解性和内在止血活性而成为一种有前景的候选材料，然而壳聚糖水凝胶在血液相容性方面的表征仍然不足。本研究评估了具有不同交联度的壳聚糖水凝胶及其与无花果蛋白酶（ficin）复合物的血液相容性和止血活性。研究人员使用1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）合成水凝胶，并通过ζ-电位测量进行表征。通过溶血、血红蛋白光谱、红细胞细胞结构（cytoarchitecture）和淋巴细胞活力测定来评估血液相容性。无花果蛋白酶通过吸附和共价结合两种方式固定化，并通过溶胀和动态血液凝固实验评估止血性能。水凝胶表现出统计学上显著的、与剂量成反比的溶血效应，这归因于其较低的胶体稳定性。相比之下，血红蛋白光谱、红细胞细胞结构和淋巴细胞活力均未显示统计学显著变化。吸附固定化比共价结合提供了更高的蛋白负载量和蛋白水解活性。与原始水凝胶相比，含无花果蛋白酶的复合物显著加速了血液凝固。这些发现证实了所开发的水凝胶及其无花果蛋白酶复合物作为血液相容性止血材料的潜力。
论文解读文章
一、研究背景与意义
出血是创伤、手术和灾害医学中导致死亡的主要原因，相当比例的死亡发生在患者到达医疗机构之前因失血过多所致。因此，能够快速止血的有效局部止血材料是生物医学工程领域的优先研究方向。目前，基于纤维素、胶原蛋白、明胶和合成聚合物的多种止血剂已进入临床实践，但其中许多存在显著局限性，包括成本高、免疫原性、生物降解有限以及在大量出血时疗效不足等问题。
壳聚糖（chitosan）是通过甲壳素脱乙酰化获得的生物聚合物，近年来引起了广泛的研究关注。壳聚糖兼具生物相容性、生物可降解性、抗菌活性和显著的止血能力等多种宝贵特性。其止血机制归因于其聚阳离子性质，这一性质源于伯氨基的存在，这些基团能够与带负电的红细胞和血小板膜发生静电相互作用，促进其聚集并激活凝血级联反应。值得注意的是，壳聚糖的使用形式——粉末或颗粒、海绵、水凝胶或冷冻凝胶、纳米纤维等——强烈影响其止血效果。已有研究表明，交联形式的壳聚糖（如海绵和水凝胶）具有最高的止血效率。然而，天然壳聚糖的机械强度有限，在生理条件下降解迅速，这显著限制了其作为伤口敷料或止血材料的应用。交联聚合物链以形成水凝胶或海绵可解决这些问题，它能提高机械稳定性、调节溶胀度和生物降解速率，并能控制孔隙率、吸附能力和细胞粘附性。
另一种改善壳聚糖基止血材料的策略是将其与具有内在凝血活性的物质功能化。例如，将海藻酸钙（凝血因子IV的来源）掺入壳聚糖颗粒中，可将肝脏撕裂伤的止血时间缩短近一半。含有纤维蛋白原和凝血酶（分别为凝血因子I和IIa，均为丝氨酸蛋白酶）的壳聚糖海绵也已有报道，这些材料表现出优异的止血性能，能在75秒内完全凝固血液，比不含蛋白酶的壳聚糖海绵有效近四倍。然而，凝血酶和纤维蛋白原价格昂贵且难以获取，这推动了寻找具有类似效果的更廉价蛋白质组分的努力。植物半胱氨酸蛋白酶在这方面尤其具有吸引力，它们易于获取、蛋白水解活性高、底物特异性广，并能降解坏死组织。研究最广泛的植物半胱氨酸蛋白酶包括木瓜蛋白酶（papain）、菠萝蛋白酶（bromelain）和无花果蛋白酶（ficin）。无花果蛋白酶分离自无花果乳胶，具有多种实际优势：它兼具高比活性和相对简单的纯化特性，并且在比木瓜蛋白酶更宽的pH范围内保持活性，包括与血液接触相关的中性条件。值得注意的是，已知无花果蛋白酶能切割纤维蛋白、激活人凝血因子X并表现出纤溶酶原样活性，这直接支持其作为止血材料级联激活组分的作用。此外，无花果蛋白酶自身还具有抗菌和抗生物膜活性，进一步扩展了所得止血剂的功能。
然而，目前关于BDDE交联壳聚糖水凝胶的研究主要集中在组织工程和药物递送应用，尚未涉及无花果蛋白酶的固定化或所得材料的止血性能。壳聚糖水凝胶对关键血液相容性参数（溶血、血红蛋白光谱特性、红细胞形态和淋巴细胞活力）的影响在很大程度上尚不清楚。这一知识空白促使了本研究的开展，旨在全面评估不同交联度壳聚糖水凝胶及其无花果蛋白酶复合物的血液相容性和止血活性。
二、主要技术方法
研究人员采用多种关键技术方法开展研究。首先，使用1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）作为交联剂，以两种不同交联剂比例（壳聚糖与BDDE摩尔比分别为1:1和1:2）合成壳聚糖水凝胶（Cross-Cs-1-1和Cross-Cs-1-2），通过透析纯化并冷冻干燥。水凝胶表征采用ζ-电位测量（Zetasizer Nano ZS仪器）和溶胀行为研究。血液样本来自30名独立健康供体（16名女性和14名男性），年龄18-45岁，所有实验均使用单一供体血液而不进行混合。血液相容性评估包括红细胞溶血测定（分光光度法）、血红蛋白光谱分析（UV-2550PC分光光度计，190-900 nm波长范围）、红细胞细胞结构评估（扫描电子显微镜JSM 6380 LV）和淋巴细胞活力测定（台盼蓝排斥法和刃天青测定法）。无花果蛋白酶通过吸附和共价结合两种方式固定化，使用偶氮酪蛋白水解反应评估蛋白含量和总蛋白酶活性。止血性能通过血液中的溶胀行为和动态全血凝固实验评估。
三、研究结果
3.1 壳聚糖水凝胶的血液相容性评估
红细胞溶血实验显示两种壳聚糖水凝胶均表现出与剂量成反比的溶血效应。水凝胶浓度降低在统计学上显著激活了溶血过程。0.1% Cross-Cs-1-2导致12%的红细胞死亡，而浓度降至0.01%时破坏了21%的细胞。Cross-Cs-1-1也观察到类似结果，浓度降低使死亡红细胞数量从17%增加至32%。这种行为可归因于壳聚糖水凝胶颗粒在水性介质中的低胶体稳定性。水凝胶合成过程中，BDDE交联剂与壳聚糖的NH?基团反应，降低了其质子化的空间可及性，导致所得结构的表面电荷降至约10-15 mV，进一步降低了悬浮液的聚集稳定性。根据ASTM分类标准，溶血率高于5%的材料被视为溶血性材料，因此Cross-Cs水凝胶属于溶血性类别，溶血率范围为12%至32%。然而，溶血率在水凝胶浓度较高时降低，表明胶体稳定性而非材料化学性质是主导因素。
血红蛋白光谱分析显示，与壳聚糖水凝胶相互作用后，氧合血红蛋白（HbO?）的光谱特征保持不变，无论水凝胶浓度如何，表明水凝胶的结构特征不影响氧合血红蛋白的光谱性质。血红蛋白形态分布分析显示，天然血红蛋白（对照）中功能性HbO?占77.8%，氧化失活形式高铁血红蛋白（MtHb）仅占0.43%。水凝胶未显著影响配体形式的含量，所有情况下变化幅度均低于1.5%，表明水凝胶不会实质性地扰动血红蛋白的氧转运功能。Cross-Cs-1-2（ζ-电位最低）在血红蛋白形态分布方面与天然血红蛋白的偏差最小。
红细胞细胞结构评估显示，天然供体红细胞中95.1%为盘状细胞，3.8%为可逆变形细胞，1.1%为不可逆变形细胞。与0.01%水凝胶悬浮液孵育后，盘状细胞数量从95.1%降至85.2%（Cross-Cs-1-1）和87.2%（Cross-Cs-1-2），不可逆变形细胞分别增加至6.2%和2.5%。虽然这些变化在测试条件下未达到统计学显著性，但表明红细胞形态分布发生了可能具有生物学意义的改变。淋巴细胞活力测定显示，Cross-Cs-1-2组的存活淋巴细胞百分比略高（83%-90%），而Cross-Cs-1-1组为73%-78%，未检测到统计学显著变化。
3.2 无花果蛋白酶在壳聚糖水凝胶上的固定化
无花果蛋白酶在两种介质中进行固定化：0.05 M Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）和0.05 M硼酸盐缓冲液（含KCl，pH 9.0）。吸附固定化实验显示，在0.05 M Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）中，Cross-Cs-1-2实现了最高的无花果蛋白酶负载量，59%的初始蛋白结合到载体上。而在pH 9.0硼酸盐缓冲液中，蛋白固定化产率不超过初始蛋白含量的10%。这归因于无花果蛋白酶的等电点约为9.0，在pH 7.4时静电作用对无花果蛋白酶-水凝胶相互作用的贡献增加，而Cross-Cs-1-2具有较低的正表面电荷，最终实现了更高效的蛋白吸附。总蛋白酶活性固定化产率遵循相同趋势，Cross-Cs-1-2最高。共价固定化中，Cross-Cs-1-2也实现了最高的蛋白负载量和催化活性，但其总蛋白酶活性固定化产率比吸附固定化低近两倍，这可能是由于酶在水凝胶表面的刚性附着限制了活性位点的空间可及性。比较两种固定化方法，吸附固定化在蛋白负载量和总蛋白水解活性两个关键参数上均更具优势，且操作简单、成本低、快速且不需要有毒活化剂。
3.3 壳聚糖水凝胶及无花果蛋白酶-壳聚糖水凝胶复合物的止血性能
在血液中孵育120秒后，Cross-Cs-1-1的溶胀比（SR）为15±1，Cross-Cs-1-2为13±2，两种水凝胶在血液中均能较快溶胀，达到统计学上无显著差异的SR值。Cross-Cs-1-2溶胀趋势较低可能归因于其较高的交联密度限制了网络在血液环境中的扩张。
动态血液凝固实验监测了止血剂与血液接触时间与545 nm处吸光度变化的关系。天然壳聚糖（Cs）在最初5-10分钟内产生最陡峭的吸光度下降并达到低平台，表明可溶性壳聚糖在该测定中是高效促凝剂，这与其强聚阳离子性质和聚集血细胞的能力一致。相比之下，原始水凝胶Cross-Cs-1-1和Cross-Cs-1-2在30分钟内仅表现出逐渐的吸光度下降，表明交联壳聚糖网络驱动的凝固过程相对缓慢。所有含无花果蛋白酶的复合物在最初5-10分钟内均比原始水凝胶产生更陡峭的光密度下降，确认固定化酶能积极加速血细胞聚集。其中，ficin + Cross-Cs-1-1（pH 7.4固定化）和ficin + Cross-Cs-1-2（pH 9.0固定化）在实验结束时达到最低吸光度值，表明这两种复合物提供了最有效的凝固。
四、讨论与结论
研究人员提出，所开发材料的止血性能源于两种互补机制的协同作用。Cross-Cs水凝胶本身通过被动"堵塞效应"发挥作用：接触血液后迅速溶胀，形成物理屏障，在伤口部位浓缩血细胞和凝血因子，促进血凝块形成。固定化的无花果蛋白酶则引入活性级联激活组分：从水凝胶释放后，无花果蛋白酶可切割纤维蛋白并激活人凝血因子X，从而加速凝血酶原向凝血酶的转化及随后纤维蛋白网络的形成。水凝胶提供物理支架和持续释放特性，而释放的酶作为凝血级联的生化加速器，两者协同作用。
研究存在以下局限性：所有实验均在体外使用供体血液和模型测定进行，未进行体内验证；水凝胶的理化表征仅限于ζ-电位测量和溶胀研究；无花果蛋白酶的释放仅通过释放介质的蛋白水解活性间接监测；所提出的无花果蛋白酶介导凝血激活机制是从动力学凝固数据和文献报道推断而来；止血性能未与临床已确立的止血剂进行比较。
综上所述，本研究成功合成了具有不同交联度的壳聚糖水凝胶，并评估了其单独及与无花果蛋白酶复合后的血液相容性和体外止血活性。水凝胶在测试条件下未引起血红蛋白光谱特征、红细胞细胞结构和淋巴细胞活力的统计学显著变化。溶血率与水凝胶浓度成反比，ζ-电位与交联度相关。吸附固定化比共价结合提供了更高的蛋白负载量（59%对29%初始蛋白）和更高的总蛋白水解活性（86%对29%游离无花果蛋白酶活性）。含无花果蛋白酶的复合物相比原始水凝胶加速了血细胞聚集。这些结果支持所开发复合物作为局部止血材料的潜力，但需要进一步研究包括凝血因子Xa和凝血酶生成的直接测量、分散体胶体状态的详细表征以及止血效果、生物降解、组织反应和长期安全性的体内评估。
