俄罗斯联邦2021–2023年高毒力禽流感病毒H5N1 clade 2.3.4.4b的输入传播、基因型演化与人兽共患潜力

《Microorganisms》：Spread of H5N1 Avian Influenza Viruses Clade 2.3.4.4b in the Russian Federation, 2021–2023

　　

高毒力禽流感病毒（highly virulent avian influenza virus）H₅N₁ clade 2.3.4.4b于2020年在欧洲因H₅N₈病毒重配（reassortment）而出现，并迅速通过野鸟传播。至2021年，该病毒已在俄罗斯联邦被检出。研究人员对俄罗斯采集的分离株进行全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）和系统发育分析（phylogenetic analysis），揭示多起病毒从欧洲国家输入的事件。2021–2023年，在俄罗斯联邦检出基因型（genotype）EA-2020-C、EA-2021-AB、EA-2022-BB、EA-2023-DA及若干未分型重配分离株（ungenotyped reassortant isolates）。黑海—里海沿岸和俄罗斯远东地区被指出可能是检测新型重配病毒形式的主要地理中心。已识别若干提示禽流感病毒人兽共患潜力（zoonotic potential）增加的关键氨基酸标记；然而，2021–2023年俄罗斯联邦未记录到多起哺乳动物中禽流感病毒检出事件。

论文解读：

研究背景方面，禽流感病毒（avian influenza virus, AIV）是引起家禽和野鸟高度传染性疾病的重要病原，主要造成呼吸系统和消化系统病变。高毒力A型流感病毒中的H₅和H₇亚型威胁最大，可在禽群中导致高达100%的死亡率，并具有跨越种间屏障的能力。俄罗斯联邦检出的高毒力AIV包括H₅亚型Gs/Gd/96遗传谱系，其祖代病毒于1996年自中国广东省鹅中分离，随后在全球演化出不同分支和亚分支。clade 2.3.4.4b病毒已在欧亚、非洲、澳大利亚和大洋洲、北美和南美及南极洲等地检出；俄罗斯联邦在2016–2021年主要报告由clade 2.3.4.4b的H₅N₈ AIV引起的疫情，2020–2021年还报告H₅N₅ AIV。自2020年起，同一分支中经重配产生的H₅N₁亚型在欧洲出现并逐渐扩散至各大陆，在鸟类和哺乳动物中引起流行。俄罗斯联邦横跨多条大陆候鸟迁徙路线，包括黑海/地中海、中亚、东亚—西非和东亚—澳大拉西亚路线， migratory wild birds可远距离携带病毒。为调查AIV/H₅N₁ clade 2.3.4.4b的出现与传播并评估其人兽共患潜力，需要对分离株进行全基因组测序，并对核苷酸和氨基酸序列进行分析与表征。原文需要明确的问题包括病毒输入来源、基因型组成、可能的重配中心和关键氨基酸标记，以及2021–2023年俄罗斯联邦哺乳动物中病毒检出情况。

研究人员开展了2021–2023年俄罗斯联邦AIV/H₅N₁分离株的全基因组测序和系统发育分析，结合EpiFlu数据库数据比较其遗传特征和可能输入路径，确定基因型并筛查与 zoonotic potential 相关的氨基酸替换。研究结论显示，俄罗斯联邦欧洲部分2021–2023年绝大多数H₅N₁检出与来自欧洲国家的病毒输入有关；黑海—里海盆地是病毒进化的重要中心；远东地区H₅N₁正逐渐形成沿东亚—澳大拉西亚候鸟迁徙路线在野鸟中循环的独立遗传群。部分关键氨基酸替换在HA₁和MP₁中固定，提示血凝素对哺乳动物细胞受体亲和力及对哺乳动物毒力增加，但2021–2023年未记录大规模哺乳动物感染事件。该研究对理解H₅N₁ clade 2.3.4.4b在俄罗斯联邦的输入、重配和演化具有重要意义，并提示持续监测的必要性。

关键技术方法概括：研究样本为2021–2023年提交至FGBI“ARRIAH”的鸟类和哺乳动物生物材料（内脏78%、粪便14%、拭子/冲洗液7.5%）及环境样本（<0.5%），其中哺乳动物内脏5份，样本覆盖俄罗斯联邦各联邦区。对实时反转录聚合酶链反应（real-time RT-PCR）AIV/H₅N₁阳性样本，用10日龄无特定病原体（SPF）鸡胚分离病毒；提取RNA后以real-time RT-PCR扩增MP和HA基因片段，反转录并PCR扩增全基因组，采用MiSeq测序，Galaxy平台组装序列。从NCBI GenBank和GISAID EpiFlu检索序列，BLAST鉴定近缘序列，MAFFT进行多序列比对，BioEdit比较分析，MEGA7以最大似然法（maximum likelihood, ML）和1000次bootstrap重复构建全长基因系统发育树，以贝叶斯信息准则（BIC）选择替代模型，Genin2确定基因型。

研究结果：
样本检测与流行动态：通过real-time RT-PCR对2021–2023年超过18,100份鸟类和哺乳动物样本检测AIV基因组，至少每年分析6000份，超过1200份AIV阳性；检出低致病性AIV多种亚型（H₉、H₃、H₄、H₆、H₁₀、H₁₂、H₁₃和H₁₆）及高致病性AIV/H₅。2021年H₅N₅、H₅N₈和H₅N₁亚型循环，自2022年起H₅N₁取代其他亚型；野鸟中H₅N₁高致病性AIV检出数增加，反映其传播动态增强。

H₅N₁ clade 2.3.4.4b首次检出与地理分布：该病毒于2021年6月底至7月初在秋明州首次检出，2021年8–9月在车里雅宾斯克州检出；2021–2023年在中央、南部、北高加索、伏尔加、西北、乌拉尔和远东联邦区检出。宿主包括野鸟（卷羽鹈鹕、天鹅、水鸭、野鸭、鹅、海鸥、海鸻、麻雀、鸽子、乌鸦等）、家禽（鸡、鹅、鸭、鹌鹑、火鸡、珍珠鸡、番鸭、鸽等）、保护区和动物园鸟类（非洲鹅、疣鼻天鹅、鸸鹋、非洲鸵鸟、珍珠鸡、孔雀等）以及哺乳动物海狗（fur seal）。

全基因组测序与系统发育分析：对55株来自不同地理区域和宿主的AIV/H₅N₁获得全基因组核苷酸序列；选择依据包括初始基因组RNA浓度较高、地理多样性和宿主种类多样，最终数据集仅纳入无缺口全基因组序列。补充EpiFlu数据库不同国家既往分离株数据后进行比较和系统发育分析；为便于展示，树中仅显示各系统发育群最早分离株，排除相同和近缘序列。通过该分析确定病毒遗传特征和可能输入路径。

基因型组成与传播特征：按欧盟参考实验室分类系统，EA-2020-C（H₅N₁-A/Eurasian_Wigeon/Netherlands/1/2020-like）27株，EA-2021-AB（H₅N₁-A/duck/Saratov/29-02V/2021-like）4株，EA-2022-BB（H₅N₁-A/Herring_gull/France/22P016177/2022-like）15株，EA-2023-DA（H₅N₁-A/mute_swan/Slovenia/PER1486-23TA/2023-like）4株，另有5株未确定基因型。2021年俄罗斯联邦分离株均属EA-2020-C，最早代表在2021年6–8月于秋明和车里雅宾斯克野鸟中检出；其PB₁、PA、HA、NP、NA、MP、NS片段与塞尔维亚2021年H₅N₁相似度达99.16–99.89%，PB₂与2020年10月以来欧洲H₅N₁相似度达99.91%。2022–2023年EA-2020-C在俄罗斯欧洲部分中央、伏尔加和南部联邦区家禽中形成一簇；远东（哈巴罗夫斯克、堪察加、马加丹和萨哈林）家禽和野鸟中形成另一组，最早代表为A/crow/Khabarovsk/776-56/2022（2022年4月），并在海狗中检出A/seal/Sakhalin/2050/2023（2023年8月）；除NS外，这些分离株与日本和加拿大2022年2月病毒最相似，NS与2021年车里雅宾斯克H₅N₁最相似。EA-2021-AB于2022年2–3月在斯塔夫罗波尔边疆区和阿斯特拉罕州家禽及卷羽鹈鹕中检出，2023年1月在加里宁格勒州检出；2022年俄罗斯分离株在PB₂、PB₁、PA、HA、NP、MP片段与英格兰2021年H₅N₁及参考株A/duck/Saratov/29-02V/2021最相似，NA和NS与俄罗斯2021年H₅N₁最相似。EA-2022-BB于2023年5–7月在俄罗斯欧洲部分（西南地区除外）主要于鸥类中检出，也有鸡感染；所有分离株与参考株全基因组高度相似，最早俄罗斯病毒A/black-headed gull/Leningrad_region/RII-WD299/2023（2023年2月）指示由欧洲野鸥直接输入。EA-2023-DA于2023年2月在南部联邦区保护区鸟类（鸸鹋、非洲鸵鸟、火鸡、鸡）中检出，与参考株A/mute_swan/Slovenia/PER1486-23TA/2023全基因组接近；其PA、HA、NP、NA、MP与2022年欧洲和埃及EA-2021-AB及EA-2022-CH基因型病毒相似，PB₂、PB₁、NS与俄罗斯2021–2022年低毒力H₃N₈相似。未分型分离株包括A/chicken/Rostov/2177-1/2021（罗斯托夫州鸡场，不同片段分别与俄罗斯2021年EA-2020-C、H₃N₈、H₅N₅和H₂N₃等最相似，难以确定起源时间和地点，ggFLU分类为欧亚基因型B.18）；哈巴罗夫斯克2022年两个近缘未分型分离株（家禽场鸡和野乌鸦，A/chicken/Khabarovsk/2404-4/2022在树中标注，与中国2022年及秋明2021年H₅N₁最相似，ggFLU B.18-5）；斯塔夫罗波尔2023年1月家禽场未分型H₅N₁（与埃及A/garganey/Egypt/SJCEIRR-RA20851OP/2022最近，ggFLU B.18-41）；卡尔梅克2023年4月卷羽鹈鹕A/pelican/Kalmykia/683-1/2023（与同地区2023年3月A/Dalmatian pelican/Kalmykia/330-10V/2023及哈萨克斯坦曼吉斯套州疣鼻天鹅2022年H₅N₁最相似，ggFLU B.18）。

裂解位点：大多数分离株蛋白酶裂解位点为PLREKRRKR/GLF；例外包括2023年南部联邦区两株EA-2023-DA为PLKEKRRKR/GLF，以及2022–2023年远东若干分离株为PLRERRRKR/GLF。该结果由氨基酸序列分析得出。

人兽共患相关氨基酸标记：所有研究病毒均存在HA₁蛋白（H₅亚型编号）156A突变，可增加病毒血凝素对哺乳动物流感病毒特征性SAα-2,6型细胞受体的亲和力；所有分离株含MP₁的30D和215A突变，提示对哺乳动物毒力增加；PB₂、PB₁-F₂、PA和NP蛋白突变存在于个别分离株，影响病毒聚合酶活性增加、毒力增强及哺乳动物免疫应答逃逸。尽管识别出人兽共患潜力增加的遗传标记，2021–2023年俄罗斯联邦未记录到表明病毒稳定跨种由鸟向哺乳动物转移的明显事件，也未记录大规模哺乳动物中H₅N₁检出事件。

讨论部分总结：依据EpiFlu数据，2021–2023年欧洲至少检出20种不同高致病性AIV/H₅N₁基因型，但多数地理和宿主传播有限；欧洲2020–2024年主要流行基因型为EA-2020-C（2021–2022）、EA-2021-AB（2022）、EA-2022-BB（2022–2023）和EA-2023-DA（2023年末），俄罗斯联邦同一观察期检出相同基因型。EA-2022-CH在欧洲中东部野鸟中于2022年末循环，但未在俄罗斯联邦检出。EA-2020-C于2020年在欧洲由广泛流行的H₅N₈病毒（HA和MP片段）与低毒力AIV重配产生，2021年经野鸟沿黑海/地中海迁徙路线输入俄罗斯联邦；系统发育结果支持病毒在春季鸟类迁徙期间从欧洲（A/swan/Serbia/19524-21/2021）传至乌拉尔（A/pelican/Russia/932-0121/2021）。2022年远东EA-2020-C检出可能与黑海—地中海和东亚—澳大拉西亚飞行路线交汇有关；2021年秋至2022年春EA-2020-C沿东亚—澳大拉西亚路线在亚洲扩散，因南西伯利亚、哈萨克斯坦、中国和蒙古同期H₅N₁信息不足，难以详细追踪；2022年日本等远东邻国检出相关H₅N₁。系统发育分析不支持H₅N₁由野鸟跨大西洋从西北欧传入北美后经北部地区进入俄罗斯远东和日本的假说，北美（尤其美国西海岸）病毒与俄罗斯远东病毒不同。EA-2021-AB于2021年9月在萨拉托夫州首次鉴定，其秋季迁徙期间检出提示可能在黑海—里海盆地至乌拉尔山地区由欧洲高毒力H₅N₁ EA-2020-C（类似A/pelican/Russia/932-0121/2021）与未识别低毒力病毒重配形成。EA-2022-BB由高毒力H₅N₁ EA-2021-AB与鸥中常见H₁₃亚型AIV重配产生，2022年法国首次检出后主要在海鸟（鸥）中扩散，较少见于鹅、猛禽、家禽和哺乳动物；俄罗斯最早病毒A/black-headed gull/Leningrad_region/RII-WD299/2023由WHO国家流感中心于2023年2月鉴定，指示由欧洲野鸥直接输入。EA-2023-DA由EA-2021-AB基因型的PB₂、PB₁、NS片段与未识别低毒力病毒在俄罗斯西南部或黑海—里海盆地邻国重配产生，沿黑海沿岸和中欧国家有限传播。2021–2023年欧洲是俄罗斯欧洲部分H₅N₁输入的主要地理来源；俄罗斯南部沿里海和黑海地区持续存在紧张态势，罕见AIV形式（包括既往未分型者）在此出现，可能与中亚、西亚—非洲和黑海/地中海三条路线交汇以及越冬期候鸟聚集和纬度迁移有关。关键人兽共患潜力标记的识别表明H₅N₁逐渐演化并固定部分增加毒力和哺乳动物细胞亲和力的突变；既往研究显示2018–2022年俄罗斯AIV/H₅基因组中存在PB₂ 292V（H₅N₈）和PB₁-F₂ 66S（H₅N₅）等毒力标记，本研究中部分病毒亦检出；MP的30D和215A替换在2018–2023年俄罗斯所有AIV中均发现，提示这些突变在基因组中固定。尽管存在人兽共患潜力增加的遗传标记，本研究的2021–2023年俄罗斯H₅N₁分离株未显示病毒由鸟向哺乳动物稳定跨种转移的明显事件，2021–2023年俄罗斯联邦未记录大规模H₅N₁在哺乳动物中检出事件；但此类突变的逐步积累可导致病毒适应新宿主，因此AIV演化研究仍属重要任务。

研究结论（译文）：研究表明，自2021年以来，禽流感病毒传播和循环的地理位置发生了变化。已确定，2021–2023年俄罗斯联邦欧洲部分绝大多数H₅N₁检出病例与来自欧洲国家领土的H₅N₁输入有关。黑海—里海盆地是病毒进化的重要中心，因为沿海附近曾零星检出罕见的H₅病毒形式。在俄罗斯远东地区检出的H₅N₁病毒正逐渐形成一个独立的遗传群，沿东亚—澳大拉西亚候鸟迁徙路线在野鸟种群中循环。研究注意到AIV基因组中HA₁和MP₁若干氨基酸替换的固定，这些替换表征病毒血凝素对哺乳动物细胞受体亲和力增加及对哺乳动物毒力增强；反映AIV人兽共患潜力增加的其他关键氨基酸替换未在不同病毒群或所研究的单一分离株中被系统发现。