线粒体DNA丰度决定肿瘤免疫原性细胞死亡：MEK抑制剂联合线粒体自噬抑制激活cGAS-STING通路增强抗肿瘤免疫

《Immunity》：Mitochondrial DNA abundance is a determinant of immunogenic cell death in cancer

　　

经历线粒体应激的细胞可发生凋亡或触发先天免疫激活的细胞死亡。研究人员探究了癌症中决定这些不同结局的机制。丰富的线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）及cGAS-STING通路的高表达是KRAS突变癌症的特征。在药物筛选中，MEK抑制剂（MEK inhibitor, MEKi）能有效诱导KRAS突变癌细胞中mtDNA释放至胞质。然而，MEKi同时也诱导PRKN介导的线粒体自噬（mitophagy），通过清除受损线粒体而限制mtDNA释放。抑制线粒体自噬可维持mtDNA外流并放大cGAS-STING信号。机制上，PRKN介导的线粒体自噬通过限制线粒体外膜透化（mitochondrial outer membrane permeabilization, MOMP）来限制mtDNA外流。mtDNA与细胞色素c（cytochrome c, cyt.c）释放的平衡决定了两种免疫学上截然不同的结局：免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death, ICD）与凋亡。在临床前模型中，MEK与线粒体自噬的联合抑制可诱导强大的树突状细胞（dendritic cell, DC）活化，并促进CD8+ T细胞介导的抗肿瘤免疫。与此一致，PRKN表达与人类癌症中的免疫浸润呈负相关。综上，这些发现为靶向线粒体动力学以增强抗肿瘤免疫的联合策略提供了理论依据。

论文解读

一、研究背景与科学问题

线粒体作为真核细胞中具有细菌进化起源的细胞器，其释放的损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs）是强大的免疫刺激信号。其中，胞质中的线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）可激活包括cGAS-STING在内的DNA传感通路。尽管线粒体外膜透化（mitochondrial outer membrane permeabilization, MOMP）被认为与应激诱导的mtDNA释放有关，但线粒体应激如何决定先天免疫激活与免疫沉默性凋亡之间的命运选择，此前尚不清楚。

免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）通过利用抗肿瘤免疫革新了癌症治疗。ICIs与化疗药物联合已成为初治癌症的标准方案，其机制可能涉及诱导免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death, ICD）。分子靶向治疗（molecularly targeted therapies, MTTs）是癌症治疗的另一支柱，但MTTs与ICIs联合的临床获益仅在少数癌症类型中得到证实，部分原因在于缺乏两者协同抗肿瘤效应的理论基础。因此，探索MTT诱导的线粒体应激如何决定肿瘤细胞的免疫学命运，对于优化联合治疗策略具有重要科学意义和临床价值。该研究发表于《Immunity》。

二、主要技术方法

研究人员综合运用了多种技术手段：利用癌症细胞系百科全书（Cancer Cell Line Encyclopedia, CCLE）和DepMap数据库进行药物敏感性与mtDNA丰度的相关性筛选分析；采用亚细胞分离结合定量PCR（qRT-PCR）检测胞质与细胞器组分中mtDNA拷贝数；通过免疫印迹（immunoblot）、免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）和免疫荧光（immunofluorescence）分析蛋白表达、相互作用及亚细胞定位；使用CRISPR-Cas9基因编辑和siRNA/shRNA介导的基因沉默进行功能验证；构建rho⁰细胞（经溴化乙锭长期处理去除mtDNA）验证mtDNA依赖性；采用透射电子显微镜观察线粒体与溶酶体互作；利用流式细胞术分析免疫细胞浸润；通过同基因小鼠肿瘤模型（CT26、LLC、CMT167）结合抗PD-1抗体进行体内疗效评估；临床样本队列包括NCC-NSCLC肺癌队列、VOLTAGE-COAD结直肠癌队列及TCGA数据库。

三、研究结果

KRAS突变与多种癌症亚型中mtDNA丰度相关

研究人员通过CCLE数据库对12种癌症类型进行筛查，发现与野生型相比，^KRAS、^TP53和^PIK3CA突变癌症呈现更高的mtDNA含量，其中^KRAS突变在胰腺癌、结直肠癌、肺癌和胆管癌中均与mtDNA表达一致相关。^KRAS突变癌症中cGAS-STING通路基线活性升高，STING表达增加。机制上，^KRAS突变通过促进活性氧（reactive oxygen species, ROS）积累，激活线粒体DNA复制因子TWKL，驱动mtDNA复制，从而形成mtDNA富集表型。临床样本分析显示，mtDNA高丰度肿瘤呈现免疫热表型，表现为树突状细胞（dendritic cell, DC）、自然杀伤（natural killer, NK）细胞和CD8⁺ T细胞浸润增加。

MEKi促进胞质mtDNA释放，诱导PRKN介导的线粒体自噬清除受损线粒体

药物筛选发现MEK抑制剂（MEK inhibitor, MEKi）敏感性与mtDNA丰度正相关。曲美替尼（trametinib, TRA）处理可诱导^KRAS突变癌细胞胞质mtDNA释放，但同时上调PRKN、PINK1和LC3B等线粒体自噬标志物，诱导线粒体自噬以清除受损线粒体。siRNA沉默^PRKN可消除MEKi诱导的LC3B积累，并激活STING-I型干扰素（type I interferon, IFN）信号。^KRAS突变癌症中PRKN表达显著低于^EGFR突变癌症，受损的线粒体自噬通过ROS-TWKL轴促进mtDNA富集。

MEKi与线粒体自噬抑制联合以mtDNA和STING依赖方式促进I型IFN反应

在8种^KRAS突变癌细胞系中，TRA仅在6种mtDNA中/高丰度细胞系中诱导胞质mtDNA释放。TRA联合氯喹（chloroquine, CQ）处理可显著增加线粒体膜电位丧失并激活I型IFN反应，而在mtDNA低丰度细胞系中无效。mtDNA耗竭（rho⁰细胞）或^STING沉默可完全消除联合治疗诱导的先天免疫反应，证实其mtDNA和STING依赖性。

PRKN降解BAX蛋白并减弱MOMP，后者是mtDNA外流所必需的

TCGA数据分析显示，PRKN同源缺失（homologous deletion, HD）肿瘤中BAX蛋白显著上调。PRKN作为E3泛素连接酶与BAX相互作用并促进其泛素化降解。TRA处理促进BAX向线粒体外膜（outer mitochondrial membrane, OMM）募集，而PRKN低表达时BAX募集增强。^BAX沉默显著减少TRA诱导的胞质mtDNA释放，而^PRKN与^BAX双重沉默完全消除该效应。^BAX沉默同时降低联合治疗诱导的STING激活、I型IFN产生和凋亡。PRKN通过降解BAX孔道限制mtDNA外流，而MEK与线粒体自噬联合抑制可持续促进胞质mtDNA释放并激活STING信号。

MTT诱导的MOMP产生两种免疫学上截然不同的细胞命运——ICD与凋亡，由mtDNA相对cyt.c的丰度决定

研究人员依据^CYCS和^MT-ND1 mRNA表达将肺癌细胞分为cyt.c富集（cc）和mtDNA富集（mt）亚型。^KRAS突变细胞中mtDNA/cyt.c比值显著升高，而^EGFR突变细胞中该比值显著降低。EGFR抑制剂奥希替尼（osimertinib, OSI）在cc亚型细胞中主要诱导凋亡而非I型IFN反应；ALK抑制剂劳拉替尼（lorlatinib, LOR）在mt亚型H3122细胞中诱导mtDNA释放和ICD，而在cc亚型H2228细胞中主要诱导凋亡。^CYCS沉默可减少凋亡并促进mtDNA释放，将细胞命运从cyt.c介导的凋亡转向mtDNA驱动的ICD。亚凋亡水平的MOMP是高效mtDNA驱动的ICD所必需的，而过度的MOMP中cyt.c外流会损害mtDNA释放。

MEKi与线粒体自噬抑制联合使mtDNA丰富的KRAS突变癌症对PD-1阻断敏感

在CT26（^KrasG12D）同基因小鼠模型中，TRA+CQ联合抗PD-1抗体的三联治疗显著抑制肿瘤生长，并在12只小鼠中实现2只完全缓解。该疗效在裸鼠（缺乏T细胞）和^Batf3-/-小鼠（缺乏常规I型树突状细胞，conventional type I DCs, cDC1s）中完全消失。CD8⁺ T细胞耗竭或IFNAR阻断完全消除抗肿瘤效应，而CD4⁺ T细胞或NK细胞耗竭无影响。三联治疗增加肿瘤内cDC1、CD8⁺ T细胞和颗粒酶B⁺ CD8⁺ T细胞浸润，并拓宽T细胞受体（T cell receptor, TCR）Vβ库多样性。肿瘤内^Sting、^Bax、^Twkl或^Tfam沉默均减弱抗肿瘤免疫，证实TWKL-mtDNA-STING依赖性机制。mtDNA低丰度CMT167肿瘤对三联治疗无反应，表明mtDNA丰度是疗效的关键决定因素。

PRKN表达与人类癌症肿瘤微环境中的免疫反应负相关

泛癌CIBERSORT分析显示，^PRKN表达与33/40种癌症类型中CD8⁺ T细胞/DC特征负相关。^PRKN表达与dsDNA传感器信号基因（^CGAS、^STING、^TBK1、^IRF3）负相关。在^KRAS突变肺癌和结直肠癌中，^PRKNLO肿瘤呈现更高的mtDNA刺激相关基因表达。^PRKN在免疫冷肿瘤亚型（如LKB1/^KRAS突变肺癌和MSS结直肠癌）中表达升高。^STING表达与^KRAS突变癌症的良好生存预后正相关，而^PRKN表达与不良预后相关。

四、讨论与结论

该研究建立了mtDNA丰度决定线粒体应激介导的MOMP免疫学结局的概念框架。在mtDNA丰富的^KRAS突变癌症中，MEKi促进胞质mtDNA释放，但同时通过线粒体自噬减弱mtDNA-STING信号。MEK与线粒体自噬联合抑制可维持线粒体应激，促进I型IFN产生和cDC1活化，驱动CD8⁺ T细胞激活。该抗肿瘤效应依赖mtDNA通过BAX孔道外流及随后的STING激活。亚凋亡MOMP可引发I型IFN反应和ICD，提示将MTT从凋亡诱导策略转变为ICD诱导策略的治疗范式。mtDNA/cyt.c丰度比值可预测MTT联合CQ治疗后的细胞命运。约70%的^KRAS突变癌症属于mtDNA中/高丰度，是联合治疗和ICI治疗的理想候选人群，mtDNA丰度有望成为临床应用的生物标志物。TWKL被确定为^KRAS突变癌症mtDNA丰度的决定因素，可作为免疫基因组精准医学的补充生物标志物。PRKN通过降解线粒体BAX孔道限制mtDNA外流，是MOMP介导的mtDNA转运的哨兵守护者。研究局限性包括CQ并非线粒体自噬特异性抑制剂，以及^PRKN表达在胰腺癌患者中的免疫抑制临床影响不一致。目前评估cobimetinib（MEKi）、羟氯喹和atezolizumab联合治疗^KRAS突变实体瘤的I/II期临床试验（NCT04214418）正在进行中。