《Plants》：Phenotypic Characterization and Transcriptomic Profiling of Ziziphus jujuba var. spinosa Seedlings Under ATP Treatment and Identification of a Novel Lupeol Synthase
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酸枣（Ziziphus jujuba var. spinosa）嫩叶在中国被广泛作为保健茶饮用，三萜类化合物已被鉴定为其核心生物活性成分之一。然而，该物种三萜生物合成途径中的关键基因仍大多未表征。在此，三磷酸腺苷（ATP）处理抑制酸枣幼苗生长，诱导部分幼苗叶片
酸枣（Ziziphus jujuba var. spinosa）嫩叶在中国被广泛作为保健茶饮用，三萜类化合物已被鉴定为其核心生物活性成分之一。然而，该物种三萜生物合成途径中的关键基因仍大多未表征。在此，三磷酸腺苷（ATP）处理抑制酸枣幼苗生长，诱导部分幼苗叶片卷曲和叶缘枯萎，并提高幼苗地上部组织中的三萜含量。转录组分析显示，大多数甲羟戊酸（MVA）途径酶基因未显著改变，部分下调，部分酶同工型轻度上调。结合基因组与转录组分析，在13个酸枣OSC家族基因中鉴定出一个轻度上调的氧化鲨烯环化酶（OSC）基因ZsLUS。酵母异源表达证实，ZsLUS编码具有催化活性的确证羽扇豆醇合酶。这些结果表明，ATP处理增强三萜积累而未统一上调MVA途径基因，提示酸枣幼苗三萜生物合成存在亚途径特异性调控模式或转录后调控机制。该工作加深了对ATP作用于酸枣三萜生物合成机制的理解，并为解析酸枣叶片三萜生物合成与积累提供了新线索。
酸枣（Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa）为鼠李科多年生灌木，被认为是中国枣（Z. jujuba Mill.）的祖先。其干燥种子Ziziphi Spinosae Semen（Sunzaoren）在中医中广泛用于镇静催眠，三萜类（triterpenoids，一类具有多种生物活性的次生代谢物）为主要活性成分。除种子外，酸枣嫩叶制成的绿茶也因镇静催眠作用受到关注，三萜类和类黄酮为其主要生物活性化合物。然而，酸枣三萜生物合成途径仍大多未知，环境因素对叶片发育及三萜含量的影响亦不清楚。三磷酸腺苷（ATP）不仅是细胞内能量载体，胞外ATP（eATP）还参与植物胁迫响应、细胞死亡、气孔运动和防御反应等。Cho等发现eATP受体P2K1可响应eATP磷酸化甲羟戊酸激酶（MVK），改变拟南芥细胞代谢。基于此，研究人员以ATP溶液作为胁迫信号处理酸枣幼苗，整合表型追踪、三萜定量、转录组分析和关键酶基因鉴定，检验ATP是否触发幼苗胁迫响应并特异上调三萜生物合成途径核心酶基因。
关键技术方法方面，所用酸枣种子来自2022年‘Jinxin No. 2’同一采收批次，经邢台学院Yansheng Wu教授鉴定。研究人员设置对照、0.05 mM ATP和0.1 mM ATP叶面喷施处理，连续4次，监测株高、真叶数和卷叶率；采用香草醛-HClO
4比色法测定地上部总三萜含量；对0.1 mM ATP组与对照地上部进行RNA测序，经HISAT2比对参考基因组、StringTie预测新基因、DEGseq2鉴定差异表达基因（DEGs），并进行GO和KEGG注释；通过BLAST和结构域筛选鉴定OSC家族，构建最大似然系统发育树；克隆ZsLUS并异源表达于WAT11酵母，经半乳糖诱导后以气相色谱-质谱联用（GC-MS）鉴定产物。
2.1 酸枣幼苗ATP处理后的表型：通过连续4次每周叶面喷施ATP并观测表型，研究发现ATP处理降低株高和真叶数，提高卷叶率，0.1 mM ATP处理部分幼苗叶缘枯萎；0.1 mM ATP处理地上部总三萜含量显著高于对照，相对增加近20%，表明ATP处理抑制幼苗生长并促进三萜积累。
2.2 转录组高通量测序与数据分析：通过对0.1 mM ATP处理及对照地上部进行RNA测序，获得39.7 Gb数据，各样本清洁数据不低于5.81 Gb，Q30不低于95.47%；共鉴定3977个DEGs，其中1895个上调、2082个下调。GO分析中细胞过程、代谢过程、结合和催化活性等类别富集DEGs较多；KEGG富集最显著通路为光合作用—天线蛋白，植物激素信号转导和MAPK信号通路虽含较多DEGs但校正后未达显著富集。
2.3 三萜生物合成途径差异表达酶基因鉴定：通过将DEGs映射至KEGG萜类骨架生物合成通路KO00900，并以严格阈值分析，发现MVA和MEP（2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸）途径多数酶基因未显著上调，部分下调；但按平均FPKM比较，MVK和磷酸甲羟戊酸激酶（PMK）基因表达约增加2倍，且基础表达较低。对中下游途径分析显示，法尼基焦磷酸合酶（FPPS）、鲨烯合酶（SQS）、鲨烯环氧酶（SQE）及OSC不同同工型表达模式存在差异。进一步通过同源搜索、结构域和长度筛选，鉴定13个非冗余OSC蛋白。
2.4 OSC家族系统发育及表达水平比较：通过将13个酸枣OSC与已知植物OSC构建最大似然系统发育树，OSC分为8簇，其中3个属于amyrin簇、6个属于多样产物簇、2个属于环阿屯醇簇、1个属于lupeol簇、1个属于lanosterol簇。基于FPKM比较，环阿屯醇簇两个OSC基因在ATP处理后表达升高；lupeol簇中LOC107417569（FEM48_Zijuj05G0005300）上调，平均FPKM由38.71升至47.51，诱导1.23倍，命名为ZsLUS；NewGene_5814基础表达较高但处理后下调，NewGene_3451基础表达低但显著上调；其余OSC转录丰度极低。
2.5 ZsLUS酵母异源表达功能验证：通过从两年生酸枣幼叶扩增ZsLUS，构建pESC-His重组载体并转化酿酒酵母WAT11，经半乳糖诱导后进行GC-MS分析，发现过表达ZsLUS的酵母产生空载体对照中不存在的新产物，其保留时间和质谱与羽扇豆醇标准品一致，表明ZsLUS编码羽扇豆醇合酶，参与酸枣羽扇豆烷型五环三萜生物合成。
讨论部分总结：原文指出，连续每周叶面喷施ATP可提高酸枣幼苗三萜含量，并认为这是首次证明ATP溶液喷施可增加酸枣幼苗三萜含量，为开发提高酸枣叶三萜积累的栽培策略提供理论依据。关于eATP改变表型，原文提到eATP可调节气孔运动，并推测ATP处理可能影响气孔调控和水分损失而致卷叶，叶缘枯萎可能与细胞死亡或防御相关，但原文明确该假设尚未验证。关于转录调控，原文强调在严格标准下多数MVA途径酶基因未显著上调，部分甚至下调，但按平均FPKM比较部分同工型略升；ZsLUS在lupeol簇中上调且基础表达较高。关于可能机制，原文结合Yang等、Chi等和Cho等的研究提出推测：ATP处理可能模拟eATP信号，激活MVK，进而影响胁迫响应信号分子和转录因子，选择性上调特定三萜途径基因，最终提高三萜积累，但原文指出该调控链仍需后续实验验证。原文认为该研究为理解木质药用植物胁迫诱导三萜积累提供新线索，并指出部分三萜生物合成酶基因可能成为提高酸枣及相关物种活性三萜含量的潜在靶点。
研究结论翻译：本研究证明，ATP处理调控酸枣幼苗生长发育，诱导生长受抑、叶片卷曲和叶缘枯萎等典型表型变化，同时促进三萜生物合成。转录组分析揭示，甲羟戊酸（MVA）途径核心酶基因在转录水平并未统一上调，而是不同同工型呈现不同调控模式；ATP诱导的酸枣三萜积累增加可能涉及尚未表征的途径特异性调控模块或翻译后修饰依赖的调控机制，这为后续解析三萜生物合成途径提供了有前景的方向。此外，通过氧化鲨烯环化酶基因分析和酵母异源表达，鉴定出新的酸枣基因ZsLUS编码确证羽扇豆醇合酶，催化羽扇豆醇形成，而羽扇豆醇是羽扇豆烷型五环三萜的核心前体。这些发现为酸枣羽扇豆烷型三萜生物合成途径中的关键酶提供了直接功能证据，填补了Ziziphus属羽扇豆醇合酶基因分子鉴定方面的空白。总体而言，该工作确立ATP作为酸枣三萜生物合成的有效诱导子，并为靶向工程化生产羽扇豆烷型三萜提供了功能基因。进一步研究将聚焦ZsLUS的时空表达模式及其上游转录调控机制，以实现酸枣羽扇豆烷型五环三萜生物合成的精准靶向调控。
