《Plants》：Effect of Temperature on the Growth Dynamics and Cell Viability of Chlorella vulgaris Under Elevated CO2 Conditions
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摘要：小球藻（Chlorella vulgaris）是用于生物质生产和CO?固定的重要平台，而温度显著影响其培养性能。本研究在间歇性恢复的高CO?气氛下，于10 L柱式气泡型光生物反应器中探究了温度对小球藻生长与细胞活性的影响。培养物在名义温度19、23、27
摘要：小球藻（Chlorella vulgaris）是用于生物质生产和CO?固定的重要平台，而温度显著影响其培养性能。本研究在间歇性恢复的高CO?气氛下，于10 L柱式气泡型光生物反应器中探究了温度对小球藻生长与细胞活性的影响。培养物在名义温度19、23、27和31°C下生长18天，每个温度设置两个独立的光生物反应器。连续监测确认平均培养温度分别为19.12±0.42、23.09±0.09、27.19±0.20和30.96±0.44°C。利用研究人员实验室此前通过配对OD???与重量法干重测量为该小球藻培养物建立的OD???-生物量转换系数（每OD单位对应0.4 g L?1），最终基于OD???估算的生物量在19、23、27和31°C下分别为5.43、5.82、5.90和4.05 g L?1，相应的平均OD推导产率分别为0.282、0.303、0.308和0.205 g L?1 d?1。反应器层面的分析未检测到19、23和27°C之间存在显著的产率差异，而31°C下的OD推导产率显著更低。非存活细胞在31°C下更早出现；在第18天，组水平存活细胞比例在19°C下为93.3%，在31°C下为91.7%。由于OD???转换系数未在各温度下独立验证，且第18天计数推导的细胞密度在19°C和31°C下相似，因此表观生物量差异的大小应被解读为一种基于OD???的响应，而非经过验证的干重生物量差异。因此，数据支持在31°C下存在温度依赖的培养响应，但未能确定其生理学或重量法基础。
高CO?条件下温度调控小球藻生长动态与细胞活性的研究解读
一、研究背景与目的
微藻作为一种重要的生物技术平台，在生物质生产、生物燃料、饲料及食品成分、色素提取、废水处理以及生物固碳等领域展现出广阔的应用前景。其中，小球藻（Chlorella vulgaris）因其生长迅速、生物量积累能力强且适应多种培养体系而被广泛研究。在封闭式光生物反应器中培养微藻能够有效调控光照、温度、气体交换和水力条件等参数，从而降低环境因素的不可控影响。然而，微藻的生长受光照强度与分布、温度、混合与通气、无机碳可用性、营养介质组成及初始生理状态等多重交互因素共同决定。改变单一操作参数不仅可能影响最终生物量浓度，还可能改变整个时间生长曲线。
温度是控制微藻生长动力学的关键因子之一，它直接影响酶促反应、光合活性、呼吸作用及其他细胞过程，且生长响应通常呈非线性特征。已有研究表明，小球藻的最适生长温度范围因菌株、培养基成分、光照条件和培养构型而异，并非物种的普遍特性。此外，温度还会影响培养物的生理状态，如改变光合生长与呼吸损失之间的平衡，热胁迫可能增加呼吸消耗。更重要的是，不利温度下生物量积累的减少可能不仅源于更高的细胞死亡率，也可能来自存活群体分裂速率或代谢活性的下降。
尽管已有大量研究探讨温度和CO?对小球藻的影响，但多数工作仅关注最终生物量浓度、平均产率或最大比生长速率，这些指标难以揭示不同温度处理间差异何时开始显现，且单独的生物量浓度无法区分净生物量形成变化与细胞活性变化。结合生物量积累与细胞活性的时间分辨研究仍相对有限。因此，本研究旨在同一光生物反应器系统中，同时分析多个温度条件下的小球藻生物量浓度、生长动态和细胞活性，以获得更完整的培养层面表征，同时避免假定存在一个通用的最适温度。
二、研究方法与技术
研究人员采用了以下关键技术方法开展实验：
- 1.
柱式气泡型光生物反应器系统：使用8个工作体积为10 L的圆柱形玻璃柱式光生物反应器，放置在密封的12 m3气室中，气室内持续通入高浓度CO?并间歇性恢复至约3 vol.%。
- 2.
多温度梯度实验设计：设置四个名义温度处理（19、23、27和31°C），每个处理使用两个独立的反应器作为重复，培养周期为18天。
- 3.
光学密度与生物量估算：通过测定750 nm处的光密度（OD???），并利用实验室前期建立的经验校准系数（0.4 g L?1 per OD单位）将OD值转换为生物量估计值。
- 4.
细胞活性评估：采用亚甲基蓝染色法，基于存活与非存活细胞膜通透性的差异，在血球计数板上进行显微计数，计算存活细胞比例。
- 5.
碳酸盐碱度滴定：通过酸碱滴定法测定培养液中碳酸盐系统的碱度，以HCO??当量表示。
- 6.
统计分析：使用单因素方差分析和Tukey HSD检验比较不同温度间的平均OD推导产率差异。
三、研究结果
3.1 温度对OD???推导生物量估计值的影响
在所有温度条件下，OD???推导生物量估计值在整个18天培养期内均呈上升趋势，但时间模式随温度而异。实验开始时各温度处理间初始OD值相近。在前三天内，19、23、27和31°C下的OD推导生物量分别达到1.114、1.251、1.307和1.118 g L?1。随着培养进行，19、23和27°C下的OD轨迹保持接近，而31°C下从中间阶段起明显偏低。第18天，四个温度下的OD推导生物量分别为5.43、5.82、5.90和4.05 g L?1，31°C比27°C低约31%。全期平均OD推导净体积产率分别为0.282、0.303、0.308和0.205 g L?1 d?1。单因素方差分析显示温度效应显著，Tukey HSD检验表明19、23和27°C之间无显著差异，而31°C的产率显著低于其他三个温度。
3.2 生长速率与OD推导产率的时序动态
所有温度下，计算得到的比生长速率在初始培养区间最高，随后逐渐下降。前三天内，19、23、27和31°C下的区间比生长速率分别为0.381、0.409、0.433和0.374 d?1。比生长速率的下降部分源于其对数定义随OD增加而自然衰减。为更直接描述OD指标的绝对变化，研究人员还计算了区间体积产率。在31°C下，OD推导区间产率从第0-6天的0.251-0.277 g L?1 d?1降至第6-9天和第9-12天的0.190和0.184 g L?1 d?1，并在第15-18天进一步降至0.114 g L?1 d?1，而同期19-27°C的值保持在0.293-0.309 g L?1 d?1。这表明31°C下较低的OD推导估计值是逐步发展形成的。
3.3 细胞活性的变化
培养开始时，所有温度处理的样品中均未检测到死细胞。第6天，仅在31°C的两个独立反应器中检测到死细胞，平均存活率约为95%。到第12天，所有处理均出现少量死细胞，19、23、27和31°C下的平均存活率分别约为98.8%、99.0%、98.5%和93.4%，31°C下的活性下降最为明显。第18天，组水平存活细胞比例在19、23、27和31°C下分别为93.3%、96.1%、93.7%和91.7%。
3.4 生长与细胞活性的关系
生物量积累的最大降幅出现在31°C，并伴随非存活细胞的提前出现。然而，生物量浓度与百分比活性是不同的量，不能直接在百分比基础上进行比较。活性数据仅作为描述性证据，表明31°C下细胞完整性丧失出现得更早。
3.5 培养液pH动态
所有处理在培养初期pH快速上升，从约6.19-6.26升至第3天的约7.7-8.1，此后变化缓慢。实验结束时，19、23、27和31°C下的平均pH分别约为8.46、8.56、8.59和8.54，各组间未见持续性分离。
3.6 气室CO?动态
从培养第5天左右开始记录的气室CO?数据显示，平均浓度为1.81±0.62 vol.%，代表性操作最大值约为3.0 vol.%。气室因平行实验需要每天开启，每次开启后重新补充CO?至约3 vol.%，形成了反复的恢复与下降模式。
3.7 滴定推导碳酸盐系统碱度
在第0、12和18天对各温度处理的一个反应器进行了酸碱滴定。表观HCO??当量值从初始的约0.12-0.18 g L?1增至第12天的1.46-1.71 g L?1和第18天的1.83-2.20 g L?1。由于改良Tamiya培养基含磷酸盐，这些值被解释为碳酸盐系统碱度当量，而非选择性直接测量。
四、讨论与结论
讨论部分指出，本研究结果清楚显示了在所研究的19-31°C范围内，OD???推导培养指标存在温度依赖性差异。31°C下OD信号和OD推导产率显著降低，而19-27°C间较小差异不应被解读为统计上确定的最近温度。这一响应与微藻生长与温度之间的一般非线性关系一致，符合Bernard和Rémond提出的至少需要最低、最适和最高三个特征温度来描述微藻温度响应的模型。与Bamba等人、Josephine等人以及Johnson等人的研究相比，本研究中温度响应的形状在不同研究间更为一致，即在上限测试温度下出现明显下降，而较低温度范围内表现相对接近。
关于生长的时间结构，研究发现31°C下较低的OD推导估计值是逐步发展的，而非仅在培养末期出现。比生长速率与区间体积产率的联合使用提供了对这一时间分化的互补视角。在细胞活性方面，31°C下非存活细胞更早出现，但活性数据本身无法区分死亡率增加与光合作用、呼吸作用或细胞分裂速率的变化。
研究结论：在所研究的间歇性恢复高CO?条件下，小球藻在19-27°C范围内表现出大致相当的OD???推导生长指标，而31°C培养则持续产生较低的OD???信号和OD推导产率。非存活细胞在31°C下更早出现，但描述性活性测量未能确定引起这一响应的生理机制。重要的是，尽管OD???-生物量经验系数先前已通过该培养物的重量法干重校准建立，但在本实验中并未在各温度下独立重新验证，且第18天计数推导的细胞密度在19°C和31°C下几乎相同，尽管OD推导生物量估计值不同。因此，31°C效应的幅度不能被解释为经过验证的干重生物量亏缺。结果支持在该光生物反应器系统中31°C下存在温度依赖的OD???/培养响应，而干物质质量、细胞大小、光学性质及其他生理变化的贡献仍未得到解决。
