酒精性肝炎患者粪便宏蛋白质组学揭示Parabacteroides distasonis来源DUF6383结构域蛋白作为预后生物标志物

《Gut Microbes Reports》：DUF6383-domain containing protein from Parabacteroides distasonis predicts survival in patients with alcohol-associated hepatitis

　　

肠道菌群失调是酒精相关性肝病（alcohol-associated liver disease， ALD）的一个特征，表现为不利菌种丰度增加和有益菌种减少。本研究旨在利用基于定量串联质量标签（tandem mass tag， TMT）的宏蛋白质组学分析，对来自国际多中心队列的酒精性肝炎（alcohol-associated hepatitis， AH）患者（n=80）、酒精使用障碍（alcohol use disorder， AUD）患者（n=20）和对照者（n=19）粪便样本中的细菌蛋白质组进行分析。研究人员在另一个由72例AH患者组成的独立多中心队列中，利用qPCR在基因组水平上验证了研究结果。研究检测到2364种细菌蛋白，并识别出区分对照组、AUD患者和AH患者的独特宏蛋白质组学特征。AUD和AH患者的特征是厚壁菌门（Firmicutes）来源蛋白减少，而拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）来源蛋白富集。18种细菌蛋白随疾病严重程度增加而升高，其中许多具有多功能“兼职”（moonlighting）作用，包括烯醇化酶（enolase）和己糖激酶（hexokinase）。来自Parabacteroides distasonis的DUF6383结构域蛋白与组织学损伤、炎症细胞浸润相关，并与宿主中性粒细胞脱颗粒有关。DUF6383结构域蛋白高丰度的患者90天生存率显著降低，这一关联在第二个队列中通过qPCR在基因组水平得到验证。研究结果表明，微生物蛋白与疾病严重程度和进展相关，而来自P. distasonis的DUF6383结构域蛋白是AH潜在预后生物标志物。

研究背景与目的

酒精相关性肝病（alcohol-associated liver disease， ALD）是全球范围内肝脏相关发病率和死亡率的主要原因之一，其疾病谱从良性肝脂肪变性发展到酒精性肝炎（alcohol-associated hepatitis， AH）。约10%-20%的酒精使用障碍（alcohol use disorder， AUD）患者会发展为AH。AH以大量饮酒后急性发作的黄疸为特征，患者常并发感染、全身炎症反应综合征和肾衰竭，影响90天死亡率。短期生存率较低，28天生存率为69%-81.5%，90天生存率为62.5%-69.1%。

酒精可导致肠道炎症和屏障功能障碍，使微生物相关分子模式（microbial-associated molecular patterns， MAMPs）易位进入体循环，增强全身免疫应答和肝脏炎症。酒精还会引起肠道菌群失调，其特征是有益菌如Akkermansia muciniphila、Bifidobacterium和Faecalibacterium prausnitzii减少，而致病菌如Enterococcus、Prevotella和Veillonella增加。既往研究多集中于分类学分析，这只能揭示微生物的存在而非其功能活性。宏蛋白质组学能够大规模表征复杂样品中的微生物蛋白表达，反映微生物组的活跃功能状态，可能发现影响疾病进展的微生物因子并识别新的生物标志物和治疗靶点。因此，本研究旨在通过定量TMT（tandem mass tag， 串联质量标签）宏蛋白质组学分析，鉴定ALD患者的微生物蛋白特征并寻找潜在的预后生物标志物。

主要技术方法

研究人员采用基于TMT的定量宏蛋白质组学技术，对来自前瞻性国际多中心研究（InTeam联盟，ClinicalTrials.gov编号NCT02075918）的粪便样本进行细菌蛋白质组分析。质谱数据搜索针对宏基因组生成的FASTA序列数据库进行，仅纳入高置信度蛋白匹配（q<0.01）。蛋白质功能注释通过blast2go和eggnogger完成。研究还利用qPCR技术在独立验证队列（AlcHepNet， NCT04072822， 美国8个临床中心）中对DUF6383结构域蛋白的基因组丰度进行验证。

研究结果

1. 细菌宏蛋白质组图谱显示对照组、AUD和AH患者粪便样本存在显著差异

通过对19例对照、20例AUD和80例AH患者的粪便样本进行TMT宏蛋白质组学分析，经质量控制后共检测到2364种细菌蛋白。主成分分析（principal component analysis， PCA）结合置换多元方差分析（permutational multivariate analysis of variance， PERMANOVA）显示，三组间的宏蛋白质组学特征存在显著差异。进一步筛选发现，18种细菌蛋白随疾病严重程度递增而升高，其中许多蛋白具有“兼职”（moonlighting）功能，如磷酸丙酮酸水合酶（烯醇化酶， enolase）和葡萄糖-6-磷酸异构酶（己糖激酶， hexokinase）。Ward层次聚类分析显示这些蛋白形成功能相关的聚类，其中Veillonella、Bifidobacterium和Clostridium相关类群是关键驱动因素。

2. DUF6383结构域蛋白可预测AH患者的短期生存

来自Parabacteroides distasonis的DUF6383结构域蛋白与60天、90天和180天死亡率呈正相关。Mallory小体水平高的患者DUF6383结构域蛋白丰度显著更高。通过最大选择秩统计将患者分为高、低丰度两组后，Kaplan-Meier曲线显示DUF6383结构域蛋白高丰度组患者的90天生存率显著低于低丰度组，且两组间MELD评分无显著差异。

3. DUF6383结构域蛋白与宿主蛋白质组的相互作用

将DUF6383结构域蛋白丰度与既往鉴定的680种宿主粪便蛋白进行Pearson相关分析，发现51种蛋白呈正相关，78种蛋白呈负相关。Reactome通路过度代表性分析显示，正相关蛋白中25%属于“中性粒细胞脱颗粒”通路，其他重要通路包括“细胞对化学应激的反应”和“自噬”。多变量Cox回归表明，P. distasonis可独立于粪便髓过氧化物酶（myeloperoxidase， MPO）预测短期死亡率。

4. 酒精性肝病中的宏蛋白质组学分类学变化

分类学分析显示，AH患者中厚壁菌门（Firmicutes）来源蛋白丰度显著低于对照组和AUD患者，而拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria）来源蛋白在AUD和AH患者中均更丰富。属水平上，AH患者中Faecalibacterium来源蛋白减少，而Bacteroides来源蛋白增加。P. distasonis蛋白的相对丰度在AH患者中显著高于对照组和AUD患者。

5. 不同门来源蛋白对AH患者死亡率的差异性影响

Spearman相关分析显示，30天死亡率主要与厚壁菌门（Firmicutes）来源蛋白（如Ruminococcus和Faecalibacterium）相关，而90天死亡率主要与变形菌门（Proteobacteria）来源蛋白（如Enterobacter、Citrobacter、Klebsiella、Escherichia coli和Morganella）相关。值得注意的是，Parabacteroides来源蛋白与30天和90天死亡率均相关。

6. DUF6383结构域蛋白作为疾病严重程度标志物的验证

在由72例AH患者组成的独立验证队列（AlcHepNet）中，通过qPCR检测粪便DNA中DUF6383结构域蛋白的基因组丰度。结果证实，DUF6383结构域蛋白高扩增水平的患者90天生存率显著更低，且两组间MELD评分无差异。

讨论与结论

宏蛋白质组学分析揭示了与AUD和AH相关的独特微生物特征。AUD和AH的特征是厚壁菌门来源蛋白减少，拟杆菌门、变形菌门和放线菌门来源蛋白富集。18种细菌蛋白随疾病严重程度增加而升高，其中一些蛋白具有代谢和宿主-微生物互作的双重功能，包括烯醇化酶和己糖激酶。来自P. distasonis的DUF6383结构域蛋白与AH的组织学特征相关并可预测90天生存率，这一发现在独立队列的基因组水平得到验证。DUF6383结构域蛋白与宿主中性粒细胞脱颗粒通路相关联。死亡率模式因分类学起源而异，厚壁菌门蛋白与30天结局关系更密切，而变形菌门蛋白主导90天风险。

关于DUF6383结构域蛋白的功能，它主要存在于未表征蛋白的C末端，与IX型分泌系统（type IX secretion system， T9SS）靶向结构域相似。T9SS仅由拟杆菌门表达，可分泌毒力因子。DUF6383结构域蛋白可能类似于被切割的C末端结构域，参与外膜转运。P. distasonis在小鼠结肠炎模型中既有保护性也有致病性报道，而在人类研究中更多与炎症效应相关。本研究的优势在于使用了两个独立的国际多中心队列，但样本量仍有限，且DUF6383结构域蛋白与生存的关联是在基因组水平而非蛋白水平验证的。

研究结论：宏蛋白质组学分析揭示了与AUD和AH相关的独特微生物特征，来自P. distasonis的DUF6383结构域蛋白可作为AH短期死亡率的预测指标。DUF6383结构域蛋白的生物学作用尚不清楚，有待进一步研究。