3-(3-羟基苯基)丙酸（3HPP）诱导骨髓来源巨噬细胞训练免疫并伴随谷氨酸相关免疫代谢重编程

《Metabolites》：3-(3-Hydroxyphenyl)propionic Acid-Induced Trained Immunity in Bone Marrow-Derived Macrophages Is Associated with Glutamate-Related Immunometabolic Reprogramming

　　

背景/目的：肠道菌群相关代谢物可能调控训练免疫（trained immunity），但其关键代谢物及机制尚不清楚。本研究旨在识别候选诱导物，并表征骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中相关的免疫代谢变化。方法：研究人员在雌性C57BL/6小鼠来源的BMDMs中筛选59种肠道微生物代谢物，依据5天静息后脂多糖（LPS）再刺激下肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）产生增强，鉴定出3-(3-羟基苯基)丙酸（3HPP）。后续分析包括浓度–反应和CCK-8（Cell Counting Kit-8）实验、转录组分析和qPCR（quantitative PCR）分析，以及代谢指标、线粒体活性氧（mtROS）和巨噬细胞表面标志物评估。结果：3HPP被鉴定为训练免疫的候选诱导物，证据为LPS再刺激后TNF-α和IL-6水平较对照组显著升高。浓度–反应和CCK-8实验支持将10 μM作为工作浓度。转录组分析和qPCR表明，参与氨基酸代谢（Gls2和Cbs）、谷胱甘肽代谢（Slc7a11、Gclc和Gpx1）、谷氨酸相关信号（Grm3）、糖酵解和免疫代谢调控（Mtor和Hk2）、线粒体调控（Ppargc1a）及表观遗传调控（Kdm5a）的基因表达发生改变。生化实验显示细胞外乳酸和谷氨酸水平升高，细胞还原型谷胱甘肽（GSH）水平、GSH + 氧化型谷胱甘肽（GSSG）合并池及GSH/GSSG比值降低，mtROS相关信号升高。流式细胞术显示CD86和CD206表达降低，其中CD206阳性细胞减少更明显。结论：3HPP在BMDMs中诱导训练免疫表型，并伴随谷氨酸相关免疫代谢变化、谷胱甘肽稳态改变以及线粒体氧化还原状态和巨噬细胞表面标志物表达变化。这些发现为微生物群相关代谢物在塑造先天免疫记忆中的潜在作用提供了新见解。

论文主体内容解读

研究背景与问题：训练免疫的发现挑战了仅适应性免疫具有记忆的传统观点。先天免疫记忆由mTOR–HIF-1α通路驱动的代谢重编程和表观遗传重塑介导，导致细胞功能长期改变。BMDMs是研究训练免疫的成熟模型；经β-葡聚糖等经典诱导物暴露后，细胞由氧化磷酸化转向有氧糖酵解，并上调糖酵解酶。然而，肠道微生物代谢物能否影响训练免疫仍大多未知。已有证据显示短链脂肪酸、吲哚-3-丙酸、氨基酸和多胺等可经表观重编程及mTOR-HIF-1α通路和有氧糖酵解调控训练免疫；酚酸类作为膳食多酚来源的重要免疫调节物可影响细胞因子合成、NF-κB信号和巨噬细胞活性。白藜芦醇可经H3K27ac表观修饰增强BCG诱导的人单核细胞训练免疫，提示酚类代谢物可能具有尚未发现的训练免疫诱导特性，但简单酚酸能否作为独立诱导物仍未知。3HPP是槲皮素和原花青素等膳食多酚经肠道菌群产生的主要代谢物，既往研究提示其可调节先天免疫环境、影响组织免疫编程，并作为母体益生菌补充改变的新生儿血浆代谢物之一参与病毒清除，因此被选为研究训练免疫的候选代谢物。

研究开展、结论与意义：研究人员建立BMDM训练免疫模型，筛选59种肠道微生物代谢物，鉴定3HPP为候选诱导物；随后通过转录组、qPCR、生化检测和流式细胞术表征谷氨酸相关信号、谷胱甘肽代谢、糖酵解及表面标志物变化。研究结论为3HPP可诱导BMDMs训练免疫表型，并伴随谷氨酸相关免疫代谢改变、谷胱甘肽稳态改变、线粒体氧化还原状态及巨噬细胞表面标志物表达变化。其意义在于为微生物群相关代谢物塑造先天免疫记忆提供新见解，并提供基于筛选框架的候选代谢物识别路径。

关键技术与方法（不超过250字）：研究使用雌性SPF C57BL/6小鼠（6–8周，20–25 g，GemPharmatech，南京）骨髓来源BMDMs；以rmM-CSF分化后建立训练模型：候选代谢物处理24 h，洗去后静息5天，再以LPS再刺激24 h。关键技术包括59种代谢物筛选与ELISA检测IL-6/TNF-α、浓度–反应及CCK-8细胞活性检测、RNA-seq（RNA sequencing，转录组测序）及GO/KEGG/GSEA分析、RT-qPCR验证、MitoSOX Red流式检测mtROS、乳酸/谷氨酸/GSH/GSSG生化检测，以及CD11b/F4/80/CD86/CD206流式表型分析。样本来源为上述小鼠骨髓来源BMDMs。

研究结果：3.1 Screening Identifies 3HPP as a Potent Trained Immunity Inducer（筛选确定3HPP为强效训练免疫诱导物）。通过两轮筛选及第三轮验证，3HPP在LPS再刺激后使IL-6和TNF-α产生升高；浓度–反应实验中10 μM的IL-6读出最高；CCK-8在1–20 μM时与对照相当或以上，50 μM时降低，支持后续使用10 μM。3.2 Transcriptomic Analysis Reveals 3HPP-Associated Gene-Expression Changes and Exploratory Pathway Signatures（转录组分析揭示3HPP相关基因表达变化和探索性通路特征）。RNA-seq显示3HPP组与对照组在主成分分析中分离，按探索性标准获得95个候选基因；GO/KEGG/GSEA结果涉及谷氨酸信号、谷胱甘肽相关过程、糖酵解/糖异生、TCA（tricarboxylic acid，三羧酸）循环、丙酮酸代谢、氨基酸生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、线粒体转录、H3K27甲基化及谷胱甘肽过氧化物酶活性等探索性趋势；原文强调这些结果未建立统计学显著通路富集或直接因果关系。3.3 qPCR Analysis Supports Glutamate-Related and Immunometabolic Changes Associated with 3HPP-Induced Trained Immunity（qPCR分析支持3HPP诱导训练免疫相关的谷氨酸相关和免疫代谢变化）。qPCR显示Gls2、Cbs、Slc7a11、Gclc、Gpx1、Grm3、Mtor、Hk2、Ppargc1a、Kdm5a以及LPS刺激后的Tnf和Il6表达升高，Grin1呈非显著上升趋势。3.4 Glutamate-Related Immunometabolic Changes and Macrophage Phenotypic Alterations Associated with 3HPP-Induced Trained Immunity（3HPP诱导训练免疫相关的谷氨酸相关免疫代谢变化和巨噬细胞表型改变）。生化检测显示细胞外乳酸和谷氨酸升高，MitoSOX Red阳性细胞比例升高；GSH、GSH + GSSG合并池及GSH/GSSG比值降低，GSSG无显著差异；流式显示F4/80⁺ BMDMs中CD86和CD206的MFI降低，CD206⁺细胞比例明显降低。原文指出这些变化不足以确定经典M1极化，但与LPS再刺激后TNF-α和IL-6反应增强相一致。

讨论总结与结论翻译：讨论指出谷氨酸除神经递质功能外也是重要免疫调节分子；3HPP诱导的训练免疫表型与谷氨酸相关信号、氧化还原调控和代谢通路变化相关。xCT（由Slc7a11编码的胱氨酸/谷氨酸逆向转运体）连接胱氨酸摄取、谷氨酸输出与谷胱甘肽合成；本研究中Gclc和Slc7a11升高，伴细胞外谷氨酸升高及GSH、GSH + GSSG池和GSH/GSSG比值下降，提示谷氨酸处理与谷胱甘肽代谢之间存在潜在联系。谷胱甘肽合成参与β-葡聚糖诱导训练免疫，本研究谷胱甘肽相关指标和mtROS信号变化进一步提示氧化还原稳态的相关性。Grm3显著上调而Grin1呈非显著趋势，谷氨酸受体相关转录变化被视为3HPP反应的潜在组分，但蛋白水平和受体功能研究仍需开展。糖酵解方面，Hk2表达和细胞外乳酸升高提示糖酵解相关代谢改变，但未直接测定糖酵解通量；Ppargc1a升高提示线粒体调控过程变化，Kdm5a升高提示表观调控变化。流式显示CD86和CD206均降低，不符合常规M1样标志物谱，但TNF-α和IL-6反应增强提示促炎功能反应增强；原文强调训练相关巨噬细胞表型变化具有刺激和情境依赖性。讨论还指出研究局限：机制解释主要基于转录组、qPCR和所选生化数据，未达FDR校正显著性的富集结果仍属探索性；CCK-8反映细胞代谢活性而非直接细胞数；SLC7A11、GRM3和mTOR等功能尚待明确；结论限于BMDM模型，体内组织巨噬细胞相关性未知；未考察性别差异；未进行全面免疫表型和系统形态学分析。

结论部分翻译：本研究识别3HPP——一种来源于膳食多酚代谢的肠道菌群相关代谢物——为BMDMs中训练免疫的强效诱导物。经3HPP预处理的BMDMs在二次LPS刺激后细胞因子产生增强，并伴随谷氨酸相关信号、谷胱甘肽稳态、糖酵解相关代谢、线粒体ROS相关信号和巨噬细胞表面标志物表达的变化。这些发现提示谷氨酸相关免疫代谢重塑可能参与3HPP诱导的训练免疫。总体而言，该工作为微生物群相关代谢物如何影响巨噬细胞功能和先天免疫记忆提供了新见解。