骨髓MHC II+巨核细胞作为非经典抗原提呈细胞在ex vivo激活CD4+ T细胞

《Cell Reports》：MHC II-expressing bone marrow megakaryocytes are noncanonical antigen-presenting cells and activate CD4+ T cells ex vivo

　　

亮点：骨髓中一个免疫活跃的巨核细胞（megakaryocytes, MKs）群体表达主要组织相容性复合体II类（major histocompatibility complex class II, MHC II）；MHC II⁺ MK可加工抗原并激活初始CD4⁺ T细胞；MK/T细胞相互作用促进转化生长因子-β（transforming growth factor-beta, TGF-β）和诱导性调节性T细胞（induced regulatory T cells, iTregs）分化；MK MHC II塑造干/祖细胞对Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）刺激的应答。
摘要：尽管专职抗原提呈细胞（antigen-presenting cells, APCs）驱动适应性免疫，非典型细胞类型可在骨髓中承担该角色。MK经典功能为血小板生成，但近期研究表明其功能异质性和免疫潜能。研究人员发现约20%的骨髓MK表达MHC II及共刺激受体CD80、CD86、CD40和CD83。这些MK以MHC II依赖方式在ex vivo加工并提呈抗原以激活T细胞。MK/T细胞相互作用诱导TGF-β1分泌并促进iTreg分化。TLR刺激MK引起适度Th1相关应答，包括干扰素-γ（interferon-gamma, IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）产生，而无强Th17分化。免疫肽组学（immunopeptidomics）证实MK MHC II在体内存在肽占据。通过靶向MK的MHC II缺失，研究人员观察到TLR应答改变及骨髓TGF-β1降低。总之，这些发现鉴定MHC II⁺ MK为非经典抗原提呈细胞，并提示其在骨髓微环境内调节CD4⁺ T细胞应答中的潜在作用。

研究背景与问题：MK是骨髓中由造血干细胞（hematopoietic stem cells, HSCs）来源的大细胞，经典功能是产生血小板，但人和小鼠骨髓MK的单细胞分析揭示转录异质性及空间和功能特化；测序研究将与抗原提呈和TLR信号基因富集相关的MK亚群归为“免疫MK”。已有研究提示MK可能通过MHC I、MHC II和共刺激分子与T细胞直接接触，但尚缺乏充分证据确认骨髓MK的功能性抗原提呈能力，也缺乏对这些细胞及其意义的全面表征。骨髓中HSC可通过MHC II加工和提呈抗原以保障HSC免于耗竭并防止恶性转化，MHC II⁺衰老HSC与调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）邻近并受其支持；骨髓Treg可通过白细胞介素-10（interleukin-10, IL-10）等直接和间接支持HSC及基质微环境。MK也调节造血：邻近HSC的MK改变HSC活性及谱系输出，MK耗竭使髓系偏向HSC向更平衡状态重编程，部分通过TGF-β1和血小板因子4（platelet factor 4, PF4）维持HSC静息，并在辐射损伤后支持骨祖细胞扩增、在应激下通过FGF1和IGF-1促进HSC增殖。然而，造血调节是否由特定骨髓MK亚群驱动或与MK免疫功能相连尚不清楚。

研究开展、结论与意义：研究人员表征骨髓中表达MHC II的MK，确认小鼠和人骨髓MK亚群存在MHC II；血小板即使活化也缺乏MHC II，提示MK表达该分子但不轻易转移至血小板；TLR激动剂poly(I:C)和脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）增强MK的MHC II和共刺激分子表达，提示功能性TLR应答；骨髓MK能以MHC II依赖方式在ex vivo激活CD4⁺ T细胞并诱导iTreg分化；MHC II⁺ MK转录组显示干扰素应答和吞噬能力上调；MK特异性MHC II缺失（Pf4-MHCΔ/Δ小鼠）改变MK对TLR激动剂的体内反应、降低骨髓TGF-β1产生，并改变骨髓干/祖细胞对TLR刺激的应答。该研究将MHC II⁺ MK定位为骨髓中的非经典免疫调节性APC，拓展了MK超越血小板生成的功能认识。

主要关键技术方法：采用MHC II-EGFP knockin报告小鼠及MK谱系特异性MHC II缺失（Pf4-MHCΔ/Δ，MHCKO）小鼠；以流式细胞术和细胞分选分析MK谱系及造血干/祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cells, HSPCs），以免疫荧光、活细胞成像和颅骨双光子活体成像定位MHC II及血小板；用OT-II初始CD4⁺ T细胞与MK离体共培养评估抗原特异性激活和iTreg分化；用bulk RNA-seq、VIPER/DoRothEA转录因子活性推断及与Sun et al.单细胞图谱整合；用MHC II免疫捕获结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行免疫肽组学；开展体内外LPS/poly(I:C)刺激、EdU增殖和潜伏相关肽（latency associated peptide, LAP）染色。人样本来自健康供者股骨头骨髓（骨髓来源MK分析4名供者）及20–22岁供者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs；3名，1女2男）。

研究结果：
1. MHC II在整个巨核细胞谱系中表达。研究人员用MHC II-EGFP knockin小鼠比较骨髓干/祖细胞群，发现17.7%±5.07的成熟MK（Lineage^?CD41⁺CD42d⁺）表达MHC II，约39%±15.74的巨核细胞祖细胞（MK progenitors, MkPs；CD150⁺CD41⁺Lineage^?Sca-1^?c-kit⁺）表达MHC II，MK偏向HSC亦富集MHC II（57.4±21.6）；MK-红系祖细胞MHC II低，沿红系谱系下降并在粒细胞-单核祖细胞重现。高维流式显示MHC II与CD41⁺ MK及MK祖细胞共表达；股骨冷冻切片显示EGFP与CD41⁺共表达；原生MK活细胞成像显示大而多倍体MK亚群表面MHC II；脾MK平均表达33.37±4.88。结论为MHC II在骨髓MK谱系亚群及髓系祖细胞中稳健表达。
2. 表达MHC II的MK在ex vivo激活CD4⁺ T细胞。骨髓MK基线表达CD80/CD86、CD40和CD83，LPS上调MHC II和关键共刺激分子；MHC⁺ MK对卵清蛋白（ovalbumin, OVA）摄取呈升高趋势（91.98±8.45% vs. 76.05±18.95%），但吞噬并非限于MHC II⁺亚群；DQ-OVA显示MK具活跃胞内蛋白酶解活性。OT-II小鼠初始CD4⁺ T细胞与载有OVA_323–339肽的MK共培养出现肽特异性CD25上调与增殖，MHC II中和抗体显著阻断；活细胞显微成像证实MK与T细胞直接互作。共培养5天后，MHC II⁺ MK在T细胞存在时以LAP量化分泌更多TGF-β；MK增加CD25⁺Foxp3⁺细胞频率，TGF-β中和抗体削弱该效应。TLR刺激后IL-17A产生极少、无Th17分化证据；poly(I:C)显著增加IFN-γ⁺细胞、LPS增加TNF-α⁺细胞，Th1相关应答（T-bet⁺IFN-γ⁺）轻度增加，Th2（GATA3⁺IL-4⁺）可忽略。人股骨头骨髓CD34⁺细胞离体分化为MK后，约40%表达HLA-DR；人MK可摄取并蛋白酶解DQ-OVA；人PBMC中循环MK的HLA-DR表达为52.6±22.1%。结论为骨髓MK以MHC II依赖方式激活初始T细胞，MK/T细胞互作与TGF-β分泌和iTreg分化相关，TLR刺激引起适度IFN-γ应答。
3. MHC II不存在于血小板。MK成熟伴内复制和多倍体化，MHC II表达跨多个倍体状态但主要见于较低倍体MK。MK与血小板蛋白组比较及主成分分析显示骨髓液与MK蛋白谱最接近，血小板与骨髓液差异最大；MHC I通路成分在MK与血小板共享，提示MHC I可转移，而MHC II相关蛋白主要限于MK。静息和活化血小板免疫染色均未检测到MHC II；MHC II-EGFP小鼠颅骨双光子活体成像中，即使LPS刺激后，GFP与GP1b亦无共定位。结论为表达MHC II的MK要么不产血小板，要么不将该分子包装入血小板，即使MHC II上调时亦然。
4. MHC II⁺与MHC II^? MK具有差异基因表达。bulk RNA-seq显示MHC II⁺ MK富集吞噬、干扰素应答和细胞黏附相关功能，MHC II^? MK富集迁移、趋化和凝血相关功能。VIPER联合DoRothEA推断转录因子活性，MHC II⁺ MK高活性TF包括Irf4、Rfx5、Irf9、Pparg和Irf1，MHC II^? MK高活性TF包括Smad4、Tbx21、Bach1和Rel。将bulk转录组与Sun et al.单细胞MK图谱四亚群整合，MHC II⁺重复样本均映射至炎症/免疫亚群（rho 0.68–0.70），MHC II^?重复样本分布于炎症/免疫和活跃周期程序；两组与产血小板及HSC微环境亚群相关性最低。结论为MHC II表达并非离散MK亚群属性，而是集中于炎症/免疫程序的免疫活跃转录状态，抗原提呈潜能富集于该状态而非为其专属。
5. MK MHC II在体内被肽占据。研究人员对原位骨髓MK进行MHC II免疫捕获及质谱分析，初始鉴定290个肽对应75个蛋白，按肽长≥9个残基、去污染并排除MHC II来源序列后，数据集为78个肽和43个亲本蛋白；超过90%肽长为9–26个氨基酸，众数15，符合经典MHC II配体；GibbsCluster无监督基序分析与数据库H2-Ab1基序一致；NetMHCIIpan v4.1以1%秩为强结合、5%秩为弱结合阈值，51.3%为强结合、5.1%为弱结合。亲本蛋白以铁蛋白轻链1（ferritin light chain 1, Ftl1）最多，其次为波形蛋白（vimentin, Vim）、腺苷酸环化酶相关蛋白1（adenylyl cyclase-associated protein 1, Cap1）和prolow-density lipoprotein receptor-related protein 1（Lrp1）；共13个表位簇，其中Ftl1来源9个肽形成显著簇；蛋白类别富集代谢（52.9%）和细胞骨架（22.1%）；62.8%亲本蛋白归入内体-溶酶体降解途径，其余归入胞质降解。结论为MK MHC II在体内被肽占据并具功能框架。
6. MK特异性MHC II缺失改变TLR刺激后的干/祖细胞。研究人员构建Pf4-MHCΔ/Δ（MHCKO）小鼠，成熟MK缺失MHC II、MkPs部分缺失、HSC极少缺失；MK数量和大小无变化；MHCKO MK失去提呈抗原并激活初始CD4⁺ T细胞的能力；稳态股骨冷冻切片LAP染色显示MHC IIKO MK的TGF-β1产生降低。体内LPS后MHCKO小鼠MK数量显著减少，poly(I:C)后MK扩增；MHCKO MK在基线和LPS/poly(I:C)刺激后共刺激分子表达改变。HSPC方面，MHCKO小鼠HSC和短期HSC轻度减少，但未见HSC增殖主要变化；LPS处理后MHCKO小鼠HSC池抗耗竭，MkP、多能祖细胞（multipotent progenitors, MPPs）2和MPP4显著增加；poly(I:C)后MPP2轻度增加。结论为表达MHC II的MK以刺激依赖方式调节MK炎症反应，并塑造骨髓干/祖细胞对TLR刺激的应答。

讨论与结论：讨论指出，骨髓MK不仅表达MHC II，也表达CD40、CD83、CD80和CD86，与免疫MK亚群转录分析一致；MHC II⁺ MK转录上集中于Sun et al.所述炎症/免疫程序，而MHC II^? MK跨越更广的免疫和周期谱，提示免疫功能可在重叠MK群体中启动。LPS增强MK的MHC II和共刺激分子表达，MK以肽特异方式在ex vivo激活CD4⁺ T细胞，MHC II阻断取消T细胞增殖；人MK约40%表达HLA-DR并可内化加工外源抗原，支持MK具APC特征。免疫肽组学中Ftl1和Vim占优提示铁稳态和细胞骨架完整性可能处于骨髓免疫监视视野，Cap1和Lrp1提示囊泡运输和脂质代谢贡献；这些肽的显著程度也可能源于蛋白丰度或肽-MHC亲和力，检测到肽并不证明相应蛋白本身参与抗原提呈通路。骨髓日益被视为免疫活跃微环境，本研究与Hernández-Malmierca et al.的工作提示非典型APC抗原提呈可作为通过与CD4⁺ T细胞直接互作保障造血的机制，并进一步提示MHC II⁺ MK可参与CD4⁺ T细胞互作；Pf4-MHCΔ/Δ小鼠骨髓TGF-β降低，未来需研究Treg功能、活性及更广泛T细胞群体以界定MK来源TGF-β或其他细胞因子减少的免疫调节后果。MK特异性MHC II缺失改变MK对TLR激动剂反应，MHCKO MK基线若干共刺激分子升高，LPS和poly(I:C)后CD80、CD83和CD86上调降低，后者可能由更广泛的细胞外变化驱动，包括缺乏CD4⁺ T细胞依赖的MHC II反馈或周围免疫景观改变。局限包括：研究确立MK可经MHC II和TGF-β在ex vivo激活初始CD4⁺ T细胞向Treg分化，且MK MHC II在体内被肽占据，但尚需确定MK是否在体内介导抗原特异性CD4⁺ T细胞 priming；蛋白组和成像未检测到血小板MHC II，但不能排除新释放血小板亚群和/或特定疾病条件下极罕见或短暂表达；免疫肽组学中内体-溶酶体注释与内源加工途径一致，但该 compartments 也处理内源膜和细胞器周转，无体内示踪时来源归因仍属推断；功能T细胞共培养使用ex vivo血小板生成素（thrombopoietin, TPO）分化MK而非新鲜分离骨髓MK，未来需用新鲜骨髓MK验证；Pf4-MHCΔ/Δ模型因观察到极少HSC缺失且PF4在HSC区室表达，不能完全排除HSC内在直接贡献或少量HSC缺失导致所有分化谱系部分缺失；分选和富集可能降低大型高多倍体MK回收，最高倍体MK在转录分析中可能代表性不足。研究结论翻译：总之，研究人员的工作提示MHC II⁺ MK可能影响骨髓中的适应性免疫；结合近期证明抗原提呈可保障HSC完整性的发现，这些结果拓展了“免疫活跃”MK和造血细胞的概念，提示在免疫相关疾病中潜在的治疗靶向途径。