断奶前后仔猪血浆代谢组学变化：基于GC-MS的非靶向代谢组学分析

《Journal of Applied Animal Research》：Blood plasma metabolomic changes in pigs from pre-weaning to post-weaning

　　

本研究旨在探讨仔猪从哺乳期到断奶后消化与代谢的生理性转变。研究人员对同一批仔猪在断奶前（d26）和断奶后28天（d54）的血浆代谢物及代谢通路进行了比较分析。仔猪除吮吸母乳外，从出生起可获取补充乳，断奶前14天开始提供开食料，并于d27日龄断奶。断奶后饲料采用自由采食方式供给。研究人员于d26和d54采集血液样本，并选取体重处于批次平均体重±1个标准差范围内的个体。采用非靶向气相色谱-质谱联用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry, GC-MS）技术鉴定血浆样本中的代谢物，并利用MetaboAnalyst（v6.0）分析断奶前后的代谢组差异。与断奶前相比，断奶后28天的仔猪血浆代谢组表现为碳水化合物代谢增强而脂肪代谢减弱，同时大多数氨基酸的相对丰度升高。例外的是赖氨酸（lysine）和缬氨酸（valine），它们在断奶后血浆中的相对丰度降低，这表明对赖氨酸和支链氨基酸（branched-chain amino acid, BCAA）的需求可能需要进一步研究。

一、研究背景与目的

断奶是仔猪生命历程中的一个关键应激阶段，此时仔猪需从依赖母猪及其乳汁的社会与营养状态，转变为独立生存。这一过程伴随着饲养环境的改变以及与非同窝仔猪的混群，由此产生的心理应激会促使糖皮质激素和儿茶酚胺等应激激素分泌，进而加速糖异生、脂解和蛋白质脱氨基作用。断奶后，仔猪的日粮由高脂肪的母乳骤然转变为以谷物为基础的固体饲料，其能量代谢模式也相应地从依赖脂肪转向依赖碳水化合物。与此同时，碳水化合物来源也从乳糖变为淀粉，这要求仔猪体内消化酶系统做出适应性调整。尽管已有研究识别了断奶对新生仔猪血浆代谢组的影响，但对于断奶及日粮转变如何长期调节血液代谢组，仍缺乏足够的信息。因此，本研究旨在鉴定仔猪在断奶时（d26）与断奶后28天（d54，即完全适应谷物型日粮后）血浆代谢组的差异，通过识别差异表达的代谢物和富集的代谢通路，增进对断奶诱导的仔猪消化生理发育的理解。

二、研究方法

研究人员采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   动物试验与样本采集：试验选用14头经产大白猪×长白猪母猪的后代，仔猪于d27日龄断奶。在断奶前一天（d26），从体重处于批次平均体重±1个标准差的仔猪中随机选取24头公猪和24头母猪进行非空腹颈静脉采血，并在d54对同一批猪再次采血。所有仔猪从出生至断奶前两天均可自由获取补充乳，断奶前14天开始提供开食料。
2. 2.
   非靶向代谢组学分析：采用非靶向气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术对血浆样本进行代谢物鉴定。原始数据经过去除污染和低置信度特征后，最终获得58种推定鉴定的代谢物。
3. 3.
   生物信息学分析：利用MetaboAnalyst（v6.0）软件进行数据分析，包括主成分分析（PCA）、配对t检验以及代谢通路富集分析。通路分析以猪（Sus scrofa）为参考物种，并使用京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库进行注释。

三、研究结果

性能

仔猪在断奶后第一周（d27-34）的平均日增重（ADG）低于断奶前两周的水平，但到d42时，ADG已超过断奶前水平（p<0.001）。这表明到d54采样时，仔猪已基本从断奶应激中恢复。

猪血浆中鉴定出的代谢物

通过非靶向GC-MS分析，共鉴定出58种推定代谢物。其中，碳水化合物占比最高（36%），其次为肽类（32%）和脂类（18%），其余为有机酸、核酸和无机化合物。

断奶前后猪血浆代谢物的差异

配对PCA得分图显示，断奶前（d26）和断奶后（d54）的血浆代谢组明显分离，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）共同解释了90.2%的变异。在58种代谢物中，有29种在断奶前后表现出显著差异（FDR<0.05）。总体趋势为：大多数醛糖（5/5）和脂肪酸及其结合物（5/6）在断奶后血浆中的相对丰度降低，而大多数氨基酸（5/7）的相对丰度升高。性别对d26或d54的血浆代谢组均无显著影响。

断奶前后猪血浆代谢通路的富集

通路分析共发现16条在断奶前后发生显著富集的代谢通路，主要涉及氨基酸代谢（n=11）和碳水化合物代谢（n=6），同时也包含脂肪代谢通路（如不饱和脂肪酸的生物合成和初级胆汁酸生物合成）。影响因子最高的通路为淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢。

四、讨论与结论

讨论部分指出，本研究通过将断奶后观察期延长至仔猪不再摄入任何动物源性成分的时间点，扩展了先前的研究。研究成功避免了急性断奶期（通常指断奶后前5天）的低采食量和应激对血浆代谢组的直接影响。断奶后血浆中大多数氨基酸丰度的升高，与仔猪更高的生长速率和蛋白质周转率一致，反映了更大的采食量和代谢活性。然而，赖氨酸（lysine）和缬氨酸（valine）在断奶后血浆中丰度降低，提示这两种氨基酸可能是未来优化断奶后日粮配方的潜在关注点。对于缬氨酸，其与亮氨酸和异亮氨酸等支链氨基酸（BCAA）之间存在转运体和酶的竞争，可能导致了其水平下降。在脂肪代谢方面，断奶后血浆中脂肪酸和胆固醇丰度的降低，以及不饱和脂肪酸生物合成和初级胆汁酸生物合成通路的下调，清晰反映了能量代谢从脂肪依赖型向碳水化合物依赖型的转变。在碳水化合物代谢方面，半乳糖代谢通路的下调和淀粉与蔗糖代谢通路的上调，对应了日粮中碳水化合物来源从乳糖向淀粉和蔗糖的转变。断奶后血浆葡萄糖水平的降低，可能源于乳糖比淀粉能更快速地代谢为葡萄糖，也可能与采样时间距最后一餐的时间间隔差异有关。

研究结论：本研究表明，非靶向代谢组学可作为检测猪代谢变化的有效工具。断奶后28天的血液样本特征在于，与断奶前一天的哺乳仔猪相比，脂肪和乳糖代谢减少。断奶后28天血浆中较高的氨基酸水平与猪较高的生长速率和蛋白质周转率相符，但血浆中赖氨酸和缬氨酸水平的降低则指出了未来需要进一步研究的方向。