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人冠状病毒229E（hCoV-229E）是一种地方性α冠状病毒，可引起人类轻至中度呼吸道感染。尽管该病毒在人群中长期传播，但其遗传多样性和进化动力学研究仍不充分，尤其是在俄罗斯。本研究旨在分析2017至2025年间在俄罗斯流行的hCoV-229E毒株的遗传多样
人冠状病毒229E（hCoV-229E）是一种地方性α冠状病毒，可引起人类轻至中度呼吸道感染。尽管该病毒在人群中长期传播，但其遗传多样性和进化动力学研究仍不充分，尤其是在俄罗斯。本研究旨在分析2017至2025年间在俄罗斯流行的hCoV-229E毒株的遗传多样性和分子特征。研究人员共分析了69,053份来自急性呼吸道病毒感染症状住院患者的鼻咽拭子样本，主要来源于圣彼得堡。采用多重RT-PCR方法鉴定呼吸道病原体。对选取的hCoV-229E阳性样本进行全基因组测序。采用最大似然法进行系统发育分析，并分析S蛋白中的氨基酸替换。使用NetNGlyc预测潜在的N-连接糖基化位点。hCoV-229E在全部八个流行季中均有流行，呈明显的春季高峰；其在急性呼吸道病毒感染中的占比范围为0.1%至11%。最常见的混合感染为与SARS-CoV-2（144例）、人呼吸道合胞病毒（hRSV，62例）和人鼻病毒（hRV，48例）的组合。基于全基因组树拓扑结构，研究人员提出两个新型基因型——基因型7和基因型8（Bootstrap >70%），其中基因型8进一步分化为亚系8a和8b。系统发育分析表明，所有当代俄罗斯分离株均归属于这两个基因型。共有137条俄罗斯全基因组序列提交至国际GenBank数据库，占所有可用hCoV-229E基因组的23.22%。在受体结合域（RBD）中，鉴定出氨基酸替换E309D、R312S和H314R（loop 1），为俄罗斯基因型8分离株的特征性突变。P358A替换（loop 2）仅见于2023年圣彼得堡的三株分离株中。预测到35个潜在N-糖基化位点，其中26个在所有毒株中保守。同时，参考株和1989年分离株中存在的S2亚基N714糖基化位点在所有现代病毒中均已丢失。本研究全面表征了hCoV-229E在俄罗斯的流行与进化，揭示了优势基因型的更替、具有独特分子标志的区域性系统发育分支的形成以及糖基化谱的变化。研究结果强调了对地方性冠状病毒进行持续基因组监测以及时发现新遗传变异的必要性。
**研究背景与意义**
冠状病毒（Coronaviridae）为一类感染哺乳动物和鸟类的RNA病毒，分为α、β、γ和δ四个属。季节性人冠状病毒229E（hCoV-229E）属于α冠状病毒属，根据国际病毒分类委员会（ICTV）现行分类，其官方名称已变更为Alphacoronavirus chicagoense。该病毒于1966年由Dorothy Hamre团队首次描述，其常见名称源自一名具有普通感冒症状的学生志愿者的实验室样本229E。目前，蝙蝠被认为是hCoV-229E的自然储库这一假说被广泛接受，该病毒可能通过骆驼科动物传播至人类。2022年在韩国一名儿科患者中检测到新型冠状病毒hCoV-KUMC22-3，与啮齿动物携带的冠状病毒亲缘关系密切，提示α冠状病毒群持续具有跨物种传播的进化潜力。
据不同数据，全球季节性冠状病毒感染率范围为1.7%至7.0%。hCoV-229E所致疾病的临床表现与其他急性呼吸道病毒感染难以区分，主要症状包括咳嗽、肌痛、头痛、发热、鼻漏和寒战，罕见情况下可累及下呼吸道、心脏、中枢神经系统和胃肠道。病毒粒子呈球形，直径120–160 nm，脂质包膜上具有棒状S蛋白突起，膜蛋白（M）支撑包膜，包膜内含有少量包膜蛋白（E），基因组与核蛋白（N）结合形成对称核衣壳。
冠状病毒S蛋白为三聚体组织，包含S1亚基（负责与宿主细胞受体结合，即RBD）和S2亚基（负责病毒与细胞膜融合，即MBD）。S蛋白首先与人氨肽酶N（APN，CD13）结合。hCoV-229E S1的N端结构域具有受体结合活性，而β冠状病毒中该活性位于C端区域。S蛋白高度糖基化（糖盾），碳水化合物链可遮蔽RBD从而逃逸抗体。RBD结构中含有三个环（loop），为全基因组中最可变的区域。过去50年中，进化过程中出现了六个RBD类别，在结合受体结合环特异性中和抗体的能力和对hAPN的亲和力方面存在差异。
基于全基因组分析，hCoV-229E可分为七个系统发育簇（基因型）。根据S基因的突变率范围为1.9–4.3×10
?4替换/年，hCoV-229E样病毒最近共同祖先可追溯至1765年。基因型1–3流行至2000年代初，而现代病毒属于簇4–7。尽管hCoV-229E等季节性冠状病毒已实现对人类宿主的长期进化适应，不构成直接大流行威胁，但其为研究冠状病毒进化基本机制提供了宝贵模型。在俄罗斯等地理代表性不足的地区追踪hCoV-229E基因组学对于识别局部进化轨迹和揭示病毒持续存在的一般原则至关重要。本研究分析了俄罗斯流行的hCoV-229E病毒的遗传多样性，确定了现代分离株的系统发育关系和分子生物学特征。
**主要技术方法**
研究人员对2017年第40周至2023年第39周期间收集的69,053份鼻咽拭子样本（主要来自圣彼得堡，通过GIHSN项目获取，另含新西伯利亚州1份、克拉斯诺达尔边疆区30份、罗斯托夫州6份、汉特-曼西自治区-尤格拉2份）进行分析，并纳入斯莫罗金采夫流感研究所收藏的1979年hCoV-229E分离株。采用多重RT-PCR鉴定呼吸道病原体及冠状病毒种类；采用PrimalScheme设计全基因组扩增引物，经Illumina DNA Prep试剂盒建库后在Illumina NextSeq 2000平台测序；使用BWA-MEM 2进行序列比对，MAFFT进行序列对齐，RAxML v.8.0以最大似然法（GTR+G，1000次Bootstrap重复）构建系统发育树；采用RDP5 v5.93检测重组事件；使用NetNGlyc v.1.0预测N-连接糖基化位点；采用广义加性模型（GAM）分析季节性分布。
**研究结果**
**季节性人冠状病毒在圣彼得堡的物种多样性（2017–2025）**：在八个流行季中，48.23%（33,303份）样本检测为呼吸道病毒阳性。hCoV占急性呼吸道病毒感染的4.4%–8.0%，在所有监测季节均有流行。hCoV-229E检出率在各季节分别为0.1%、3.6%、0.7%、11.0%、1.2%、0.4%、0.8%和5.9%，呈明显春季高峰和两年周期性。共鉴定1,861例混合感染，最常见组合为hRV/SC2（210例，11.3%）、hRSV/hRV（157例，8.4%）和hCoV/SC2（144例，7.7%）。四种人冠状病毒在整个监测期间均被检出，优势型别呈季节性交替。
**系统发育特征与比较基因分析**：基于全长基因组的系统发育重建提出两个新型基因型——基因型7和基因型8（Bootstrap >70%），基因型8进一步分为亚系8a（Bootstrap = 100）和8b（Bootstrap >70%），与来自中国、英国、美国、马来西亚和日本的毒株遗传关系密切。2024–2025年当代病毒聚集为以俄罗斯序列为主的独立谱系。137条俄罗斯全基因组序列提交至GenBank，占全球所有可用hCoV-229E基因组的23.22%。基于S和ORF1a基因的系统发育显示，ORF1a树与全基因组拓扑一致，而S基因树在基因型6和8内显示额外分支。RBD loop 1中的E309D、R312S和H314R替换共同定义基因型8内的一个独立簇，涵盖当代俄罗斯分离株。RBD loop 2中的P358A替换仅见于2023年圣彼得堡三株分离株（PQ616070、PQ616072、PQ616073）。S蛋白氨基酸替换分析揭示了突变与特定基因型出现的明确关联：K309E首次出现于基因型3分支基部，E309D/K随后在基因型8中固定；S312R为基因型4标志，R312S标记基因型8；G314V标记基因型3，V314P定义基因型4，P314H和H314R依次在基因型8中固定；358位点进化显著，D358A见于基因型6，A358P见于基因型7，而三株俄罗斯分离株呈现P358A突变。俄罗斯分离株间核苷酸同一性极高（99.1%–100.0%），与参考株HCoV-229E相似性为98.6%–98.9%，与其他人类冠状病毒相似性显著较低（HCoV-NL63约67%，β冠状病毒低于50%）。四基因缠结图显示大多数序列在四个位点系统发育位置一致，部分拓扑不一致提示可能重组，但RDP分析未确认。
**N-糖基化位点分析**：在S蛋白氨基酸序列中预测到35个潜在N-连接糖基化位点，其中26个在所有分析毒株中保守。参考株ATCC VR-740和1989年分离株中存在的S2亚基N714糖基化位点在所有其他序列中缺失。
**讨论与结论**
本研究对2017至2025年俄罗斯联邦流行的hCoV-229E的流行与分子遗传特征进行了全面分析。流行病学监测显示hCoV-229E在所有分析流行季均有流行，呈波动动态并具有明显春季季节性，在急性呼吸道病毒感染中占比0.1%–11%，呈两年周期性。混合感染中最常见为hCoV与SARS-CoV-2组合（144例），提示同科病毒间可能存在竞争或协同相互作用。
系统发育分析表明俄罗斯分离株属于两个新提出的基因型7和8。基因型8俄罗斯分离株以RBD loop 1的E309D、R312S和H314R替换为特征，这些替换在其他基因型及基因型8基部分支中缺失，提示其作为该分支分子标志的潜力。P358A替换仅见于2023年三株圣彼得堡分离株，提示可能出现局部变异体。ORF1a系统发育树重现了全基因组树拓扑，可能反映基因间进化速率差异或表面糖蛋白所受选择压力。尽管多基因缠结图揭示基因间系统发育不一致，但分析未确认明确的基因型间重组事件，此现象更可能由差异进化速率和特定基因组区域的不同选择压力驱动——非结构多蛋白（ORF1）因在病毒复制中具有必需酶功能而受进化约束，表面刺突糖蛋白则持续进化。S蛋白N-糖基化预测显示高度保守的糖基化谱，但当代毒株丢失了参考株和1989年分离株中存在的N714位点。
研究结论指出，本研究全面表征了hCoV-229E在俄罗斯的流行与进化，证明了优势基因型的更替、具有独特分子标志的区域性系统发育分支的形成以及糖基化谱的变化。研究结果强调了对地方性冠状病毒进行持续基因组监测以及时发现新遗传变异并理解冠状病毒科病毒一般进化模式的必要性。
