Vachellia tortilis subsp. tortilis（Fabaceae）叶绿体基因组的完整特征与比较分析

《Biology》：Characterization and Comparative Analysis of Complete Chloroplast Genome of Vachellia tortilis subsp. tortilis (Fabaceae)

　　

Vachellia tortilis subsp. tortilis为豆科（Fabaceae）旱地树种。Vachellia属包含164个种、38个亚种及25个变种。该属的分类地位历史上一直不稳定，该属近期才从Acacia属中分出。本研究对V. tortilis subsp. tortilis的叶绿体（cp）基因组进行了测序和表征，并与相关物种进行了比较。V. tortilis subsp. tortilis叶绿体基因组总长度为164,956 bp，包含132个基因：87个蛋白编码基因、8个核糖体RNA基因及37个转运RNA基因。简单重复序列分析显示，V. tortilis subsp. tortilis叶绿体基因组含有273个重复序列。密码子使用偏好性分析显示，V. tortilis subsp. tortilis叶绿体基因组共编码24,633个密码子。系统发育分析揭示Vachellia属内存在两个明显的分支：第一支由V. tortilis subsp. tortilis与Vachellia tortilis subsp. raddiana组成，第二支包括Vachellia flava、Vachellia seyal和Vachellia nilotica。本研究增进了对Vachellia属内进化关系的认识，并提供了有价值的遗传资源。

研究背景方面，Vachellia tortilis（曾用名Acacia tortilis）是豆科旱地树种，被视为中东和非洲旱地生态系统的关键种（keystone species）。该物种原归于Acacia属，现被归入豆科含羞草亚科（Mimosoideae）的Vachellia属。Vachellia属嵌套于含羞草族（Mimoseae）的Parkia分支内，包含164个种、38个亚种和25个变种，V. tortilis分为5个亚种：tortilis、heteracantha、spirocarpa、raddiana和campoptila。旱地生态系统中的生物多样性因植被过度开发而持续遭受空前退化和破坏，V. tortilis是能在干旱土地上存活的少数野生金合欢之一，是保护的关键物种，因此需要在物种水平了解遗传结构、在亚种水平了解遗传变异以辅助其保护。基因组序列相对稳定，为解决分类问题提供数据参考和理论依据。被子植物叶绿体基因组通常为母系遗传，具有高度保守性、种内变异极小、几乎不发生重组且基因组较小等特点，是物种鉴定、系统发育分析和比较分析的有效手段。近年来叶绿体基因组数据在解决各分类层次复杂系统发育关系方面发挥了突出作用，可作为植物条形码克服传统DNA条形码（rbcL、matK、ITS）的不足。此外，叶绿体基因组编码区与非编码区之间存在显著的进化速率差异，适合研究种内等多个分类层次。Vachellia属的进化关系备受关注，但利用叶绿体基因组开展的研究数量有限，仍需更多的表征和比较分析研究来阐明该属内种和亚种间的关系。为此，研究人员对V. tortilis subsp. tortilis的叶绿体基因组进行了测序、组装和注释，构建了系统发育树，并开展了比较分析，旨在深入了解V. tortilis subsp. tortilis在种内水平及其在Vachellia属内相关物种中的叶绿体基因组特征。

研究人员开展了以下研究并得出相应结论：获得了V. tortilis subsp. tortilis完整的叶绿体基因组，其总长164,956 bp，含132个基因，GC含量35.38%，呈现典型的四分体结构；简单重复序列分析发现273个重复序列，以单核苷酸A/T重复为主；密码子使用偏好性分析显示基因组编码24,633个密码子，亮氨酸密码子最丰富、半胱氨酸最少，相对同义密码子使用度（RSCU）分析显示28个密码子RSCU>1且92.8%以A或U结尾；核苷酸多样性分析鉴定出8个高变异区域；序列差异分析显示非编码区变异大于编码区；系统发育分析将Vachellia属分为两个分支，Senegalia senegal位于Vachellia分支的姐妹位置。研究意义在于增进了对Vachellia属进化关系的认识，提供了有价值的遗传资源，支持了这些分类单元归于Vachellia属而非Acacia属的现行分类。

关键技术方法方面（不超过250字）：研究人员从沙特阿拉伯Jabal Uhud/Medina地区（24°30′48.0″ N 39°37′04.6″ E）采集新鲜叶片，经硅胶保存，凭证标本（编号KAU-V24087）保存于阿卜杜勒阿齐兹国王大学标本馆；由BGI Genomics公司完成DNA提取、文库构建和测序，采用DNBseq平台，获得43,132,243条clean reads。使用NOVOPlasty v4.3.3（K-mer=33）以V. tortilis subsp. raddiana（KY100265）为参考进行组装，GeSeq注释，序列提交GenBank（PZ387862）。采用MISA鉴定SSR，MEGA v12.1分析密码子使用，IRscope比较IR边界，DNAsp v6.12.03分析核苷酸多样性（窗口600 bp、步长100 bp），mVISTA v2.0进行基因组序列差异分析，MAFFT v7.313比对后用IQ-TREE v2.2.2.6以最大似然法（ML）构建系统发育树（TVM+F+I+G4模型，10,000次超快自举重复）。

研究结果方面：（1）V. tortilis subsp. tortilis叶绿体基因组特征：通过测序组装获得长164,956 bp的环状四分体结构基因组，包括一对反向重复区（IR，各26,049 bp）、大单拷贝区（LSC，93,658 bp）和小单拷贝区（SSC，19,200 bp）；总GC含量35.38%，IR、LSC、SSC的GC含量分别为42.67%、32.5%、29.65%；平均测序深度9798×；共132个基因（113个唯一基因），含87个蛋白编码基因、8个rRNA基因和37个tRNA基因；18个基因在两个IR区重复，包括7个蛋白编码基因（ndhB、rpl2、rpl23、rps7、rps12、ycf1、ycf2）、4个rRNA基因和7个tRNA基因；rps12基因出现于IRa和IRb区，其第三个拷贝位于LSC区；基因组含18个内含子，ycf3和clpP1含多个内含子，trnK-UUU含最大内含子（2587 bp）。（2）简单重复序列、密码子偏好性与IR边界：SSR共273个，主要分布于LSC区，包括235个单核苷酸、11个二核苷酸、14个三核苷酸、11个四核苷酸、1个五核苷酸和1个六核苷酸重复；重复单元以腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）为主；SSR分布为LSC区216个（79.1%）、SSC区47个（17.2%）、IR区10个（3.7%）；最长SSR为18 bp（LSC区），最短为8 bp；编码区共编码24,633个密码子，亮氨酸最丰富（11.70%），半胱氨酸最少（1.93%）；28个密码子RSCU>1且92.8%以A或U结尾，31个密码子RSCU<1且83.8%以C或G结尾，仅3个密码子RSCU=1；AGA（Arg）是唯一RSCU>2的过表达密码子；五个基因组IR、LSC、SSC区长度相似，反映结构稳定性，但存在少数结构变异：rpl22基因见于V. tortilis subsp. tortilis的LSC区而在其他类群中缺失，V. nilotica的IRa/LSC交界涉及rps19基因，ycf1基因仅见于V. nilotica的IRa区而其他类群位于IRa/SSC交界处。（3）核苷酸多样性与基因组序列差异：五个Vachellia物种的π值为0.00000–0.03100，鉴定出8个高变异区域（π≥0.018）：LSC区的trnQ-UUG（0.01833）、trnS-GCU（0.03100）、trnG-UCC（0.01867）、trnL-UAA（0.01967）、atpE（0.01900）、ycf4（0.02400）、cemA（0.02233）及SSC区的ycf1（0.02667）；以V. flava为参考的比较分析显示非编码区核苷酸分歧大于编码区，编码区分歧基因包括matK、trnK、rpoC2、psaA、ycf1、ycf2、ndhD、ccsA和ndhF；V. nilotica序列分歧最大，而V. tortilis subsp. tortilis与V. tortilis subsp. raddiana序列几乎相同。（4）系统发育树：基于5个Vachellia类群和4个其他豆科类群的叶绿体基因组序列重建系统发育，Vachellia类群分为两个分支，一支为V. tortilis subsp. tortilis与V. tortilis subsp. raddiana，另一支分为两个亚支，其一含V. flava与V. seyal，其二仅含V. nilotica；Senegalia senegal位于Vachellia分支的姐妹位置，Acacia crassicarpa、Mimosa bimucronata和Parkia timoriana关系最远；所有分支均获得完全自举支持。

讨论部分总结：本研究报道了V. tortilis subsp. tortilis完整叶绿体基因组，长164,956 bp，编码132个基因，GC含量35.38%，呈现其他被子植物基因组中观察到的典型保守四分体结构；IR区GC含量最高（42.67%），可能与其结构稳定性及所有rRNA基因位于该区有关；113个基因中18个含内含子，内含子含量在被子植物叶绿体基因组中高度保守；SSR分析显示273个重复，单核苷酸重复占主导，与AT丰富性有关，与大多数被子植物叶绿体基因组报道一致，SSR因高突变率成为评估遗传多样性和支持生物多样性保护的有价值分子标记；密码子使用偏好性反映基因或物种起源、时间变化和进化过程，叶绿体基因组表现高密码子使用偏好性，由自然选择与突变偏倚的平衡驱动，因GC含量低而偏好A/T结尾密码子；IR区边界扩张和收缩在被子植物叶绿体基因组中常见，可能导致基因组大小变异、基因重复或缺失及假基因形成，五个基因组IR区高度保守，但rpl22基因仅见于V. tortilis subsp. tortilis的LSC区，该基因在豆科某些类群中曾报道为假基因；核苷酸多样性分析显示π值0.00000–0.03100，鉴定出8个突变热点，其中trnS-GCU区间（π=0.03100）在基因间区最高、ycf1区间（π=0.02667）在编码区最高，这些区域可能作为物种水平鉴定的有效DNA条形码，ycf1基因被认为是叶绿体基因组变异最大的区域之一并广泛用作陆生植物DNA条形码；序列差异分析显示五个基因组高度保守，但在matK、trnK、rpoC2、psaA、ycf1、ycf2、ndhD、ccsA和ndhF基因中检测到少数变异区域，其中一些标记已用于不同被子植物系统发育研究，这些高多样性区域作为Vachellia属物种特异性DNA条形码可能有价值；Vachellia属进化关系此前未完全解决，仅依赖有限数量的叶绿体标记，基于叶绿体基因组的系统发育分析显示五个Vachellia类群完全一致并分为两个分支，与先前研究结果一致，含Senegalia senegal的分支是Vachellia分支的姐妹，亦与先前研究一致，这些结果支持Vachellia属内类群的现行分类 placement，并否定此前将这些物种归入Acacia属的分类。

研究结论部分翻译：本研究对V. tortilis subsp. tortilis的基本特征进行了表征和比较，并分析了碱基组成、SSR、密码子使用、IR边界、核苷酸多样性（π）、基因组序列差异和系统发育关系。V. tortilis subsp. tortilis叶绿体基因组长164,956 bp，共含132个基因，包括273个SSR（多为单核苷酸A/T重复）。此外，基因组编码24,633个密码子，π值为0.00000–0.03100，鉴定出显示核苷酸分歧的基因包括matK、trnK、rpoC2、psaA、ycf1、ycf2、ndhD、ccsA和ndhF，为变异最大的区域。观察到少数结构变异：V. tortilis subsp. tortilis中rpl22基因见于LSC区，但在其他Vachellia类群中完全缺失。系统发育树中Vachellia属分为两个分支：第一支代表V. tortilis subsp. tortilis与V. tortilis subsp. raddiana，第二支代表V. flava、V. seyal和V. nilotica；Senegalia senegal被恢复为Vachellia分支的姐妹分支。本研究结果验证了这些类群归于Vachellia属而非Acacia属的现行分类。建议进一步对Vachellia物种进行叶绿体基因组测序，以加强比较分析、开发物种特异性标记并增进对该属内进化关系的理解。