膳食几丁质梯度对杂交石斑鱼生长性能、肠肝健康及肌肉质构的剂量效应与南极磷虾粉利用启示

《Biology》：Effects of Dietary Chitin Inclusion on Growth Performance, Intestinal and Hepatic Health, and Muscle Texture in Hybrid Grouper (Epinephelus fuscoguttatus ♀ × E. lanceolatus ♂)

　　

摘要：南极磷虾（Euphausia superba）粉是有价值的水产饲料原料，但其富含几丁质的外骨骼可能限制养分利用。研究人员通过为期12周的试验，评价了在鱼粉基础饲料中添加0、1.5%、3.0%或6.0%几丁质对杂交石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus ♀ × E. lanceolatus ♂）的影响。膳食几丁质未显著影响存活或生长。然而，摄食率（FR）和饲料转化率（FCR）先升高后降低，而蛋白质效率比（PER）在所有添加水平均下降。在1.5%水平，肠道几丁质酶活性及白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）降低。在≥3.0%水平，血清总胆红素（T-BIL）含量、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性、AST/ALT比值、血浆脂多糖（LPS）含量和二胺氧化酶（DAO）活性升高，而肠道黏多糖（MPS）、溶菌酶（LZM）、免疫球蛋白M（IgM）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-8（IL-8）降低。在6.0%水平，脂肪酶活性进一步降低。部分肝脏免疫标志物在1.5%膳食几丁质时下降，而另一些仅较高水平下降。相反，白细胞介素-10（IL-10）在≥3.0%时升高，提示肝脏免疫稳态改变而非广泛性免疫抑制。肝脏抗氧化能力在6.0%时降低。膳食几丁质≥1.5%还降低肌肉硬度、胶黏性和咀嚼性。这些结果表明，即使在测试的最低添加水平（1.5%），膳食几丁质也影响饲料利用和肌肉质构，提示需要进一步研究低于1.5%的添加水平。

研究背景与目的：全球水产养殖快速扩张，使水产饲料对营养性蛋白源的需求持续增加。肉食性养殖鱼类的饲料仍高度依赖鱼粉，但鱼粉供应和成本受渔业资源、气候、国际贸易及市场动态影响。因此，寻找营养充足、功能有益、安全且供应稳定的替代蛋白源十分必要。南极磷虾（Euphausia superba）资源丰富、营养地位较低，磷虾粉富含优质蛋白、磷脂、虾青素等生物活性营养物质，但含有较高水平几丁质。原文指出，研究人员所在研究组前期分析显示南极磷虾粉几丁质含量为7.90%—8.43%（未发表资料）。几丁质是由N-乙酰-D-葡萄糖胺经β-(1 → 4)糖苷键连接的无支链多糖，是甲壳类外骨骼、昆虫表皮和真菌细胞壁的主要结构成分。适量添加几丁质及其衍生物（0.5%—2.0%）可促进养殖鱼生长和免疫应答，但几丁质结构稳定、水溶性差，过量可能抵抗消化道降解，影响养分消化吸收、利用效率及肠道功能和代谢稳态。不同鱼种对几丁质的降解利用能力差异明显，因此其营养效应取决于添加水平、物种摄食习性、消化生理和内源几丁质分解能力。既往原料替代研究多关注全昆虫或甲壳类原料，难以区分几丁质本身与其他蛋白、脂质、矿物质和生物活性成分的效应。因此，有必要在营养受控条件下独立评价几丁质效应，明确其是否构成磷虾粉高水平添加的主要限制。杂交石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus ♀ × E. lanceolatus ♂）是亚洲重要养殖品种，具有生长快、肉品质优、市场价值高和环境耐受性广等特点。该研究旨在系统评价梯度膳食几丁质对杂交石斑鱼生长性能、饲料利用、肠道生理反应、肠道微生物、肝脏健康和肌肉质构的影响，并评估所试几丁质水平对南极磷虾粉利用的实际意义。

研究人员开展的研究及结论意义：研究人员开展12周饲养试验，设置0、1.5%、3.0%、6.0%几丁质添加水平，结果发现膳食几丁质未显著影响存活和生长，但降低饲料利用效率；1.5%水平即影响饲料利用和肌肉质构，≥3.0%水平与更广泛的肠道和肝脏生理指标改变相关，6.0%水平还进一步降低脂肪酶活性和肝脏抗氧化能力。研究提示，使用基于磷虾粉的饲料时应控制几丁质水平，并为后续研究低于1.5%的几丁质水平和实际磷虾粉利用提供参考；但该研究未确立安全添加上限。

关键技术方法：研究人员从广东湛江东南码头附近商业养殖场获取初始约15.00 g杂交石斑鱼幼鱼，经2周驯化后，将360尾鱼随机分配至12个0.5 m³玻璃钢缸（30尾/缸），设4个饲料处理、每处理3个重复，进行12周饱食投喂试验。饲料以鱼粉、棉籽浓缩蛋白和豆粕为主要蛋白源，分别添加0、1.5%、3.0%、6.0%几丁质制备等氮等能饲料。测定生长与形态指标、全鱼和饲料常规组成、前肠/后肠/肝脏酶活与生化指标、血浆LPS/DAO/内皮素-1（ET-1）、肠道和肝脏免疫指标、肝脏苏木精-伊红（H&E）染色和透射电镜（TEM）、实时定量PCR（RT-qPCR）、FM与C6组后肠16S rRNA扩增子测序及绝对定量、背部肌肉质构剖面分析（TPA）；采用单因素方差分析、Duncan多重比较、线性和二次趋势分析及错误发现率（FDR）校正。

研究结果：
3.1 生长性能：通过12周生长试验，存活率为82.22%—90.00%，组间无显著差异；膳食几丁质未显著影响生长性能和形态指标；FR和FCR随几丁质增加先升高后降低，均在C1.5组最高，PER在所有添加组显著降低，FR、FCR和PER呈显著二次趋势。
3.2 全鱼组成：全鱼粗蛋白、粗脂肪、灰分和水分无显著组间差异；灰分呈显著正线性趋势，粗脂肪呈显著二次趋势。
3.3 消化酶活性：前肠胰蛋白酶和Na⁺/K⁺-ATPase活性无显著差异；后肠几丁质酶活性在≥1.5%时显著降低，前肠脂肪酶活性仅在6.0%时显著降低；脂肪酶和几丁质酶呈负线性趋势，Na⁺/K⁺-ATPase呈正线性趋势。
3.4.1 肠道黏膜通透性：血浆LPS含量和DAO活性随膳食几丁质水平升高而升高，ET-1有升高趋势但无显著差异；C1.5组LPS和DAO与FM组无显著差异；LPS和DAO呈显著正线性趋势。
3.4.2 肠道生物屏障：通过FM和C6组后肠16S rRNA测序，FM组微生物丰富度高于C6组，两组ASV分别为674和204，共享70个；主坐标分析（PCoA）前两轴解释36.69%和26.40%变异；门水平以Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Fusobacteria和Bacteroidota为主，C6组Proteobacteria和Actinobacteria绝对丰度较低；属水平以Lactococcus、Romboutsia、Staphylococcus、Turicibacter和Nesterenkonia为主，C6组Staphylococcus和Turicibacter绝对丰度较高，Romboutsia和Lactococcus较低。
3.4.3 肠道化学屏障：肠道黏蛋白2（MUC2）无显著组间差异；MPS含量和LZM活性随几丁质水平升高而降低，C1.5组与FM组无显著差异；MPS和LZM呈负线性趋势，MUC2亦呈负线性趋势但总体处理效应不显著。
3.4.4 肠道物理屏障：肠道ZO-1、Occludin和Claudin-15相对表达无显著差异，且无显著线性或二次趋势。
3.4.5 肠道免疫屏障：肠道聚合免疫球蛋白受体（pIgR）无显著差异；IgM、TGF-β1、TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6和IL-8显著降低，显著响应阈值因指标而异；C1.5组IgM、TGF-β1、IFN-γ和IL-8与FM组无显著差异；IL-10随几丁质增加而升高，C1.5和C3组与FM组无显著差异；FDR校正后IgM、IL-10、TGF-β1、IFN-γ、IL-1β、IL-6和IL-8呈显著线性趋势，仅IL-8呈显著二次趋势。
3.5 血清生化指标：血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（T-CHO）和白蛋白（ALB）无显著差异；C3和/或C6组血清T-BIL、AST、ALT及AST/ALT比值显著升高；T-BIL、AST、ALT和AST/ALT呈显著正线性趋势。
3.6 血清免疫指标：血清碱性磷酸酶（AKP）活性和IgM含量无显著差异；血清LZM活性从C1.5组起显著升高，补体C3和C4仅在C3和C6组显著升高；C1.5组C3和C4与FM组无显著差异；FDR校正后LZM、C3和C4呈正线性趋势，IgM和LZM呈二次趋势。
3.7.1 肝脏形态结构：H&E染色显示FM组肝组织结构总体保存、肝细胞排列较规则并可见部分胞质空泡化；C1.5和C3组亦见肝细胞空泡化，但总体结构大体完整；C6组可见肝细胞空泡化和部分形态变化，总体组织构筑仍维持；TEM显示C6组肝细胞轻度细胞器肿胀、细胞形态不规则并出现脂滴。
3.7.2 肝脏免疫功能：肝脏IFN-γ、IL-1β和IL-8在1.5%几丁质时显著降低；LZM、IgM、TGF-β1、TNF-α和IL-6在≥3.0%时显著降低；IL-10在≥3.0%时显著升高，C6组最高；FDR校正后9项肝脏免疫指标均呈显著线性趋势，仅IL-8呈显著二次趋势。
3.7.3 肝脏应激调节能力：C6组肝脏Atf3、Atf4和Keap1相对表达显著高于其他组，Nrf2表达显著低于其他组；4个基因均呈显著线性和二次剂量反应趋势。
3.7.4 肝脏抗氧化能力：肝脏丙二醛（MDA）仅在C6组显著升高；T-AOC、过氧化氢酶（CAT）活性和谷胱甘肽（GSH）含量在C6组显著低于FM、C1.5和C3组；ROS呈显著总体处理效应，超氧化物歧化酶（SOD）活性无显著差异；ROS和MDA呈正线性趋势，T-AOC、CAT、SOD和GSH呈负线性趋势，MDA和T-AOC呈显著二次趋势。
3.7.5 肝细胞凋亡：肝脏Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9 mRNA相对表达无显著组间差异；Caspase-3呈显著线性趋势，其他基因无显著线性或二次趋势。
3.8 肌肉质构：膳食几丁质显著降低肌肉硬度、胶黏性和咀嚼性，黏附性、弹性、凝聚性和回复性无显著变化；硬度、胶黏性和咀嚼性呈负线性趋势，硬度和胶黏性呈显著二次趋势。

讨论部分总结：原文讨论指出，1.5%—6.0%膳食几丁质未显著影响存活和生长，但降低饲料利用效率；鱼类对几丁质的反应具有明显物种、原料来源和添加水平依赖性。1.5%组FR和FCR最高、PER最低，而更高水平部分恢复，呈非单调响应；由于未直接评价适口性、拒食、摄食率和养分消化率，其机制尚不明确，提示低于1.5%的几丁质水平可能更有利于维持饲料利用效率。血浆DAO和LPS在3%和6%组升高，与肠道通透性增加和屏障完整性受损一致；但紧密连接相关基因Occludin、ZO-1和Claudin-15转录未显著改变，原文强调紧密连接基因转录不变并不必然代表屏障功能完整。肠道MPS和LZM在较高几丁质水平降低，MUC2和pIgR无显著差异；多种细胞因子降低而IL-10升高，提示肠道免疫相关反应和黏膜免疫稳态受到调节，而非广泛性免疫抑制。FM与C6组后肠微生物丰富度和组成存在差异，C6组Lactococcus和Romboutsia绝对丰度降低、Staphylococcus和Turicibacter升高；原文强调这些结果仅建立关联，不能证明微生物介导的因果机制。血清T-BIL、AST、ALT和AST/ALT在≥3.0%时升高，提示高水平几丁质可能增加肝脏生理负担并诱导肝脏应激反应；但缺乏种特异参考区间，单凭这些标志升高不足以确认肝细胞损伤。肝脏形态和抗氧化状态变化，尤其6.0%组，进一步提示高水平几丁质可能加重肝脏生理应激；Keap1-Nrf2通路受抑及Atf3、Atf4上调与细胞应激信号增强和抗氧化调节受损一致。原文指出，肠道屏障紊乱与肝脏应激可能存在关联，但无直接证据追踪肠源性因子转位或后续肝脏信号，不能确认肠—肝轴因果机制。肌肉硬度、胶黏性和咀嚼性降低，而全鱼常规组成无显著变化，提示质构变化不能仅由全鱼粗蛋白或粗脂肪解释；由于未直接检测肌纤维组织学、胶原含量和肌肉抗氧化状态，也未评价蒸煮损失、持水力和感官特性，相关机制及实际意义仍需进一步研究。局限包括：小麦淀粉被几丁质逐步替代并伴随饲料灰分变化、商品几丁质理化特性可能影响结果；未直接评估养分和几丁质消化率及饲料适口性；肠道反应主要基于生理生化指标而缺乏组织学评价；微生物分析仅限FM和C6组；缺乏种特异生化参考区间且形态观察为定性；部分商业免疫测定法的物种特异性验证有限；仪器质构测定不能完全反映鱼肉感官品质。未来需纳入更低几丁质水平和实际南极磷虾粉研究。

研究结论部分翻译：膳食几丁质添加水平为1.5%时损害杂交石斑鱼饲料利用并改变肌肉质构特性，而≥3.0%水平与肠道和肝脏生理指标的更广泛改变相关。尽管存活和生长性能未受显著影响，但所有含几丁质饲料均显示饲料利用较差。根据研究人员未发表的南极磷虾粉几丁质测定值（7.90%—8.43%），1.50%膳食几丁质理论上相当于17.8%—19.0%磷虾粉添加量。这些发现为磷虾粉利用提供参考，但未确立安全添加上限。有必要使用更低几丁质水平（<1.5%）和实际磷虾粉开展进一步研究。