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## 三、摘要翻译
核糖体蛋白S6激酶（ribosomal protein S6 kinase，S6K）是雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路中调控细胞生长与代谢的保守效应因子。家蚕（*Bombyx mori*）中S6K在个体水平的生物学功能尚未通过直接遗传操
## 三、摘要翻译
核糖体蛋白S6激酶（ribosomal protein S6 kinase，S6K）是雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路中调控细胞生长与代谢的保守效应因子。家蚕（*Bombyx mori*）中S6K在个体水平的生物学功能尚未通过直接遗传操作加以检验。本研究联合运用CRISPR/Cas9介导的基因敲除、基于piggyBac转座子的转基因回补与过表达技术，以及多组织RNA测序（RNA-seq）与加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA），在体内（in vivo）系统解析BmS6K的功能。BmS6K缺失突变体可存活，但雄性与雌性蛹重分别下降26.5%与28.6%。此外，突变体存活率较对照分别降低44.2%（雄性）与28.5%（雌性），死亡集中于五龄幼虫后期。靶向转基因回补可恢复上述表型缺陷。相反，在野生型背景下过表达BmS6K使幼虫生长速率提高16.9%，并显著增加全茧重与蛹重。针对三种组织的WGCNA分析鉴定出一个核心共表达模块（MEred），该模块显著富集于质子转运V型ATP酶（V-type ATPase）活性与液泡复合体组装、mTOR信号通路及与细胞氧化还原稳态偶联的氧化磷酸化相关基因，包括BmV1-ATPase、BmGabaT与BmNadDac，其同源基因在果蝇与哺乳动物中代表TOR-S6K通路的核心组分或介导关键交叉调控，该功能具有保守性。鉴于BmS6K的缺失与获得对生长和存活力产生相反效应，其可作为提高蚕茧产量的候选靶标，亦可作为通过抑制其同源基因实现基于RNA干扰（RNAi）的鳞翅目害虫防控的靶标。
## 四、论文解读
### 研究背景与科学问题
S6激酶（S6K）基因家族以核糖体蛋白S6激酶1为代表，是真核生物细胞信号网络的核心效应因子，作为mTORC1（雷帕霉素靶蛋白复合物1）通路的关键下游靶标，将营养与代谢信号转导至蛋白质合成，调控细胞生长、增殖与代谢适应等核心过程，其生长调控功能在真核进化中高度保守。在昆虫中，S6K保留了保守的生长调节功能，同时获得了谱系特异性特征。在果蝇（*Drosophila*）中，*S6k*下调可减小体尺寸并显著延长成虫寿命，建立了S6K与衰老调控的遗传联系；S6K对无脊椎动物生殖生理亦不可或缺，如日本沼虾（*Macrobrachium nipponense*）中抑制S6K表达会破坏卵巢发育并损害卵母细胞成熟；饥饿条件下的转录组分析进一步将S6K定位为mTORC1的核心下游效应因子及介导昆虫营养应激适应性反应的ERK7通路信号整合节点。然而，在经济重要鳞翅目昆虫中，S6K功能的体内遗传学证据仍然缺乏。
家蚕（*Bombyx mori*）既是全球重要的经济昆虫，也是成熟的鳞翅目模式生物，具有幼虫快速生长、极高蛋白质合成能力以及与蚕丝生产相关的明确经济性状，并具备成熟的CRISPR基因组编辑与转基因平台和丰富的多组学资源。目前关于家蚕BmS6K的功能研究十分有限，既往研究仅从表达谱数据推断其参与家蚕核多角体病毒（BmNPV）感染，而其对生长与发育进程的直接效应尚未系统检验，缺乏通过靶向基因操作获得的确定性体内遗传学证据。由此提出两个基本问题：其一，BmS6K是否因果性调控家蚕个体生长与存活；其二，BmS6K缺失会引发何种组织特异性转录改变。为解决上述问题，研究人员采用敲除、转基因过表达、遗传回补与多组织转录组谱分析相结合的综合策略，系统解析BmS6K的生长调控功能，研究结果可为家蚕生长相关性状的遗传改良提供参考，并可能对其它经济昆虫的遗传改良与靶向害虫防控策略的发展产生更广泛意义。
### 主要关键技术方法
研究人员以家蚕大造（Dazao）品系为材料，在标准实验室条件下饲养（25 ± 1.0 °C、12:12 h光暗周期、50–70%相对湿度），所有基因组分析比对至家蚕参考基因组，基因注释集取自SilkBase。关键技术包括：一是基于CRISPR/Cas9的基因敲除，于第三外显子编码区设计两条单链引导RNA（sgRNA），体外转录后与Cas9蛋白孵育形成核糖核蛋白复合物，显微注射至电激活后2 h内的去滞育蚕卵，经G0、G1代繁育获得纯合G2突变体并建立稳定敲除品系；二是基于piggyBac转座子的转基因过表达，构建IE1-BmS6K-SV40表达盒与3×P3-EGFP-SV40标记的载体，与A3辅助质粒共注射，经EGFP荧光初筛、Wristwatch-PCR（wwPCR）插入位点定位及qRT-PCR转录验证，建立敲除背景回补系与野生型背景过表达系；三是多组织转录组测序与生物信息学分析（fastp、HISAT2、StringTie、DESeq2差异表达分析、DAVID功能富集）；四是基于TBtools中WGCNAshiny模块的加权基因共表达网络分析及枢纽基因挖掘。表型测定采用五龄起蚕，每组三个生物学重复、每重复15头，其中过表达试验中过表达系与对照同容器共养以消除环境混杂因素。
### 研究结果
**BmS6K的表达谱及其在鳞翅目中的进化保守性。** 基于EXP832转录组数据，BmS6K转录本丰度在预蛹期后部丝腺达峰，幼虫期广谱表达，四龄至游走期在中肠、头部、脂肪体与丝腺中水平较高，胚胎期与蛹期整体表达较弱，除预蛹后部丝腺外性腺中亦有较高表达，但BmS6K扰动未显著影响生育相关表型。系统发育重建、蛋白结构域比较与基因组共线性分析表明，BmS6K与其它鳞翅目同源蛋白聚为支持良好的鳞翅目特异分支，核心功能结构域在所有代表物种中一致保留，侧翼基因共线性亦保守，说明S6K在蛋白序列与基因组结构层面于鳞翅目中均具进化保守性。
**CRISPR/Cas9介导的BmS6K敲除与鉴定。** BmS6K为位于10号染色体的多外显子基因座，含9个外显子；在第三外显子编码区设计两条sgRNA以引入移码突变。经筛选与纯合繁育获得两个独立稳定突变系（#-5与#-14），Sanger测序证实两个等位基因均携带导致开放阅读框移码的核苷酸缺失，产生提前终止密码子与截短失活的BmS6K蛋白，后续功能研究选用#-5系。
**BmS6K缺失损害家蚕生长与存活。** 形态观察显示纯合敲除雌成虫体尺寸明显小于野生型对照；蛹重测定表明雄、雌敲除个体分别仅保留野生型的73.5%与71.4%，即降低约26.5%与28.6%，基因型差异极显著。25天Kaplan–Meier存活分析显示，敲除显著降低两性存活率，观察期末敲除雄性与雌性最终存活率分别为50.6%与65.5%，而野生型分别为90.70%与91.67%，log-rank检验证实两基因型存活曲线显著分离。表明BmS6K功能缺失严重损害家蚕生长性能与存活。
**转录组谱揭示BmS6K调控的基因与通路。** 对脂肪体、中肠与头部三种组织测序，无监督层次聚类显示同组织同处理组生物学重复紧密聚簇，对照组与敲除组在各组织内分为不同亚簇，提示敲除相关转录组改变具组织特异性。差异表达分析在脂肪体检出136个差异表达基因（DEGs，上调40、下调96），中肠1028个（上调484、下调544），头部转录响应最强，共1047个（上调473、下调574）；三组织中下调DEGs均多于上调，提示BmS6K主要正向关联核心转录程序。脂肪体中脂肪生成（FAS）、丝氨酸生物合成（SER3）、蛋白水解周转（CATH）及TRYA、IF4E、CATO等代谢基因广泛下调；中肠中SV2B、PEG3、FIBL、S25下调而UGT2、SETMR上调；头部中IF4E、TRYA、MTH2、S25、FIBL受抑而COGS、LP4被诱导；S25与FIBL在中肠与头部均一致下调，代表跨组织保守的BmS6K响应基因。
**WGCNA鉴定与BmS6K相关的基因共表达网络。** 全基因层次聚类划分出10个独立共表达模块，BmS6K响应基因优先聚集于特定模块。模块–性状关联分析显示MEred模块与BmS6K敲除呈最强负相关且统计显著性最高，与组织类型无显著相关，提示其为跨组织普遍效应模块。功能分析显示MEred基因显著富集于质子转运ATP酶活性、V型ATP酶复合体组装、跨膜转运蛋白活性、氧化磷酸化及溶酶体功能等过程；模块内高连接度枢纽基因与网络中突出DEGs构成后续机制解析的高优先级候选。
**piggyBac转座子介导的BmS6K过表达与分子验证。** 显微注射后G0与野生型交配，G1幼虫经荧光显微镜筛选眼特异性EGFP个体为阳性转化体，兄妹交配后荧光标记稳定遗传，wwPCR确定插入位点位于22号染色体10378628位。五龄1–6日整虫qRT-PCR显示过表达系BmS6K表达水平持续高于对照，多个时间点差异显著，证实过表达系构建成功。
**转基因回补恢复敲除突变体的生长与存活缺陷。** 通过piggyBac介导将全长编码序列重新引入BmS6K?/?背景建立回补系。回补系幼虫在五龄1–4日体重显著低于野生型对照，但随发育生长速率加快、差距逐渐缩小，至五龄5–6日与对照相当且无统计学差异；雌雄全茧重与茧层重与对照无显著差异，而蛹重显著高于对照，表明BmS6K重新表达不仅恢复正常生长，还对蛹期生物量积累具额外促进作用。
**野生型背景下BmS6K过表达增强幼虫生长与茧质性状。** 过表达系雌雄蛹均明显大于对照。五龄0日起连续监测体重显示，转基因幼虫五龄早期体重显著低于对照，差异随发育缩小并于五龄3日失去统计学意义；五龄中期后进入加速生长阶段，至五龄后期体重显著高于对照。五龄0日至6.5日平均生长速率较对照提高16.9%（0.36–1.90 g vs. 0.32–2.12 g），提示过表达提高五龄平均生长速率并驱动补偿性追赶生长。雌雄过表达系全茧重与蛹重均显著增加，而茧层重无显著差异。
### 讨论与结论
讨论部分指出，本研究提供稳健的双向遗传学证据，表明BmS6K是家蚕生长与存活性状的核心正向调控因子，其功能呈剂量依赖性：功能缺失、野生型与功能获得基因型间一致的表型梯度证实其正向调控作用。BmS6K时空表达模式与其生理角色及扰动后表型大致吻合：五龄中肠高表达支持其经营养感知与代谢调节促进幼虫生长，脂肪体中等表达与其基础合成代谢及蛋白周转相关，预蛹后部丝腺转录峰值提示可能参与丝腺生理，但由于过表达系茧层重未显著增加，尚无BmS6K驱动丝蛋白合成的直接证据，需开展丝素与丝胶定量、丝腺大小与茧层率测定及丝纤维力学性能表征等靶向后续研究；五龄中后期生长相关组织的高表达窗口与过表达系受限的生长加速期相对应，暗示其可能与蜕皮激素、保幼激素等内分泌信号协同，支持将干预限于该生理敏感窗口以减少系统性干扰。进化保守性与鳞翅目特异性功能分化方面，系统发育、结构域构筑与共线性分析一致表明S6K在鳞翅目中的进化保守性，但S6K扰动的表型后果在类群间差异显著：果蝇*S6k*突变体可存活且体尺寸减小，而家蚕BmS6K缺失严重损害存活并影响结茧，该结茧相关表型可能反映家蚕特化的产丝生理背景；鉴于遗传冗余、发育时序差异与品系背景效应均不足以解释这一深度保守TOR通路效应因子的功能分化，长期驯化被视为该表型差异的首要假设，正式验证需开展群体遗传分析及野生与家养品系比较研究。转录组与WGCNA分析表明BmS6K以强组织特异性方式调节基因表达，脂肪体、中肠与头部DEGs分别关联代谢稳态与合成代谢、解毒与先天免疫及核糖体蛋白合成、糖基化与脂质结合及翻译机器，S25与纤维蛋白原样蛋白在中肠与头部一致下调，代表连接BmS6K信号与翻译效率及免疫应答的保守下游效应因子；MEred模块与敲除状态相关性最强（r = ?0.96，p < 0.001）且与组织类型无关，显著富集于V型ATP酶组装、氧化磷酸化、跨膜转运与溶酶体功能，提示BmS6K并非独立调控单个基因，而是通过协调以能量供应、物质转运与蛋白生物合成为中心的跨组织调控轴系统支持个体生长与应激适应力，为BmS6K作为mTORC1核心下游效应因子在鳞翅目中的保守功能提供了体内证据。转化应用方面提出两条策略：一是通过组织特异性启动子或CRISPR激活在中肠与丝腺适度上调BmS6K以稳定提高蛹重、支持蚕蛹综合利用而不延长幼虫发育或损害蚕丝力学性能，但需在商业品系中进一步验证；二是针对棉铃虫（*Helicoverpa armigera*）与小菜蛾（*Plutella xylostella*）等主要鳞翅目害虫中高度保守的S6K同源基因开发dsRNA或小分子抑制剂，并优先选择鳞翅目特异序列区域以降低对非靶标生物的影响，雷帕霉素衍生物等已表征的哺乳动物S6K抑制剂可为化合物筛选与安全评估提供成熟参考。未来尚需探究mTORC1与ERK7等上游调控输入并鉴定BmS6K的直接磷酸化底物。
结论部分译文：本研究提供了双向遗传学证据，支持BmS6K是家蚕生长与存活的正向调控因子。CRISPR/Cas9介导的BmS6K敲除导致蛹重与存活率显著降低，靶向重新引入BmS6K可恢复所观察到的缺陷表型，验证了BmS6K缺失与生理损伤之间的因果关系。在野生型背景下过表达BmS6K可选择性地加速五龄后期幼虫生长，并主要通过增加蛹期生物量提高全茧重与蛹重；重要的是，BmS6K过表达系茧层重保持不变。转录组分析表明，BmS6K缺失与能量代谢、物质转运、溶酶体功能及蛋白质合成等过程的全局转录改变相关。总体而言，上述发现为BmS6K在家蚕中的生长调控作用建立了功能框架，并为进一步机制解析与蚕蛹综合利用奠定了基础。
