靶向血凝素（HA）保守非受体结合表位的抗体3CF5广谱中和历史与新发H5Nx流感病毒

《Cell Reports》：Antibody 3CF5 neutralizes historical and emerging H5Nx influenza viruses by targeting a conserved non-receptor-binding hemagglutinin epitope

　　

高致病性H5Nx亚型禽流感病毒持续构成大流行威胁。研究人员用H5N6疫苗免疫恒河猴，并获得30株H5反应性单克隆抗体（mAbs）。其中3株IgG mAbs（3CF5、3BG3和3BE7）对多种H5Nx病毒表现出强效中和活性，并在致死性小鼠攻毒模型中提供保护。值得注意的是，3CF5对1997—2024年间H5Nx病毒表现广谱中和，包括与奶牛疫情相关的当代clade 2.3.4.4b H5N1毒株。冷冻电镜（cryo-EM）分析显示，3CF5靶向血凝素（HA）头部一个保守的非受体结合表位，该表位跨越残余酯酶（VE）结构域及相邻侧表面。3CF5主要通过抑制膜融合介导中和，并具有抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。此外，将3CF5-IgG转换为黏膜分泌型IgA1（sIgA1）后，其对H5N1病毒的中和能力最高增强128倍，突显sIgA1作为鼻腔给药预防剂的优势。

研究背景方面，野生鸟类和家禽中循环的禽流感病毒（AIVs）持续通过基因重配产生具有大流行潜能的H5Nx变异体，并可偶发人畜共患溢出。2024年北美奶牛中H5N1大规模出现并伴牛传人事件，提示宿主范围扩大；A/Texas/37/2024（H5N1）（TX24）在雪貂中呈高效直接接触传播和高毒力，而人间病例多较轻，这种差异使未来适应轨迹难以预测，也使提前疫苗准备在经济上不可行。HA是流感病毒主要表面糖蛋白，由HA1和HA2组成，HA1形成球状头部并含受体结合域（RBD）和残余酯酶（VE）结构域，HA2形成茎部并含融合肽。既往H5 HA头部特异性人mAbs在clade 2.3.4.4 H5Nx中因HA 130-loop和190-helix等氨基酸替换而中和力下降，因此需要具跨clade保护的广谱中和mAbs。康复者血浆和康复者来源mAbs受生物安全与地域限制，而恒河猴免疫球蛋白基因与人高度保守，研究人员据此用H5N6疫苗免疫恒河猴，经单B细胞PCR获得抗H5Nx mAbs。

研究人员获得30株H5反应性mAbs，筛选出3CF5、3BG3和3BE7三株IgG mAbs，它们对多种H5Nx病毒具强效中和并在致死性小鼠模型中提供保护；3CF5对1997—2024年H5Nx广谱中和，包括当代clade 2.3.4.4b H5N1；cryo-EM显示3CF5靶向HA头部保守非受体结合表位，跨VE结构域及相邻侧表面；3CF5主要抑制膜融合并具ADCC；3CF5-IgG转换为黏膜sIgA1后中和力最高增强128倍。这些结果扩展了H5特异性脆弱位点谱，为广谱抗体和黏膜预防策略提供依据。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员用rH5N6/GZ14灭活疫苗免疫中国恒河猴（GIBH），经单B细胞PCR克隆V_H/V_L并表达人IgG1；采用ELISA、微量中和（MN）、血凝抑制（HI）和生物膜干涉（BLI）；以PR8反向遗传构建H5Nx重组病毒；在BALB/c小鼠进行致死攻毒保护试验；用冷冻电镜（cryo-EM）解析复合物；用酵母表面展示（YSD）丙氨酸扫描定位表位；分析GISAID EpiFlu 22,547条H5Nx HA序列；用健康供者PBMC开展NK脱颗粒ADCC；进行pH依赖构象/胰蛋白酶敏感性和IgG至mIgA1/dIgA1/sIgA1工程化。

研究结果如下。克隆免疫恒河猴来源H5特异性mAbs：两剂rH5N6/GZ14疫苗免疫后HI和MN滴度升高，W15分选HA特异性记忆B细胞，单细胞PCR获得30株结合H5N6/GZ14 HA的mAbs，其中24/30与远缘H5N1/HK97 HA交叉结合，16/30中和rH5N6/GZ14，9株亦中和rH5N1/HK97，据此选择3CF5、3BG3和3BE7。mAbs 3CF5、3BG3和3BE7对历史与新发H5Nx显示广谱交叉结合和中和：对rH5N1/TX24的IC₅₀分别为0.35、0.01和1.22 μg/mL；3CF5对全部测试病毒中和最广，对rH5N6/GZ14的IC₅₀为3.71 μg/mL；3BG3对多数H5N1强效但未中和rH5N1/HK97；3BE7对rH5N6/GZ14强效（IC₅₀=0.04 μg/mL）。3CF5在100 μg/mL内无HI活性，提示非受体阻断机制；3BG3具强HI活性；3BE7对rH5N6/GZ14强HI、对其他H5N1有限。BLI显示3CF5对5种HA均高亲和结合（K_D=1.00—1.79 nM）；3BG3对4种HA高亲和（K_D=0.40—3.45 nM）但不结合H5N1/HK97；3BE7仅对H5N6/SC14和H5N6/GZ14较强。系统给药3CF5、3BG3和3BE7对rH5N6/GZ14攻毒完全保护：BALB/c小鼠感染后24 h单次腹腔注射10 mg/kg，三组均100%存活且体重稳定，对照mAb组体重下降并需安乐死。Cryo-EM显示3CF5结合HA上独特非RBS表位：3.28 ?结构显示每HA三聚体结合3个Fab，表位位于HA膜远端头部侧表面，接触RBD下侧并邻近VE，空间上区别于190-helix；结合仅由重链介导，埋藏面积869 ?²，其中HCDR3埋藏439 ?²、约占51%；RBS被相邻原体N165糖基化来源的SIA-GAL-NAG自糖基占据，3CF5结合不阻碍唾液酸受体结合，与无HI活性一致。Cryo-EM显示3BG3结合典型RBS表位：3.06 ?结构显示3BG3直接结合RBS，重链和轻链均参与，埋藏面积804 ?²，HCDR和LCDR分别贡献462和342 ?²；HCDR3深入唾液酸结合口袋并空间阻断受体结合，与强HI和直接阻断受体结合一致。3CF5表位在H5Nx中高度保守：竞争结合显示3CF5与65C6、100F4和H5M9强竞争，与3BG3和FLD21.140弱竞争；3BE7竞争模式类似3BG3。YSD丙氨酸扫描鉴定11个关键残基使3CF5结合下降>50%，其中Y164-HA、T167-HA和N168-HA替换可降至90%；关键残基位于VE结构域及RBD侧方，22,547条H5Nx HA序列中3CF5接触残基保守度为90.99%—99.79%，仅115位例外；3BG3表位总体保守，但H5N1/HK97中E126D、A133S、D155S和N189K等替换可解释其逃逸。3CF5抑制膜融合并诱发Fc介导的细胞毒效应：pH 5.0胰蛋白酶敏感性试验中，3CF5 IgG和Fab均保护HA免于低pH诱导构象变化；NK脱颗粒试验中3CF5呈浓度依赖性诱导CD107a⁺IFN-γ⁺，与H5M9和100F4相当，而S309无此效应。3CF5由IgG转换为黏膜sIgA1增强中和力：mIgA1对6种代表性H5Nx平均增强15.6倍（3.3—85.7），dIgA1平均20.6倍（3.7—98.4），sIgA1平均25.0倍（3.0—128.0），对H5N1最高增强128倍，支持鼻内sIgA1用于黏膜预防。

讨论部分指出，美国奶牛clade 2.3.4.4b H5N1疫情凸显高致病性AIV持续大流行威胁，广谱中和抗体具即时可用和跨clade保护优势。3CF5靶向保守RBD-VE界面，结合模式独特，对近三十年H5Nx具 exceptional 跨clade活性，并中和历史H5N1和当代clade 2.3.4.4b H5N1/H5N6；其下侧侧表面结合模式带来融合抑制和Fc依赖效应双重机制，表位受结构约束且高度保守。研究也指出，3CF5介导选择压力下的逃逸路径尚待研究，未测试替代病毒逃逸替换对中和及适应性的影响；与近期人H5N1广谱抗体相比，3BG3和3CF5跨clade谱更广。临床转化需优化抗体格式和给药途径，鼻内或雾化黏膜递送有利于早期遏制；sIgA1增强可能源于亲和力/亲合力提高及铰链柔性。恒河猴平台因人免疫球蛋白同源性高、免疫应答与人类关键结构和功能特征趋同，有利于快速人源化和转化。局限性包括体内保护仅评估10 mg/kg较高剂量、未用Fc工程变体在体内直接解析Fc效应、逃逸谱未完全刻画。研究结论翻译：总之，这些发现勾勒了从恒河猴免疫到治疗开发及合理免疫原设计的转化路径，有助于加强对当前H5N1威胁和未来人畜共患溢出事件的防范准备。