《Cell Reports》：Influenza virus antagonizes self-sensing by RIG-I to enhance viral replication
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先天免疫传感器必须精细区分病原体与宿主，以便仅在感染期间启动应答。RIG-I是一种细胞质传感器，在感知外源RNA后触发广泛的抗病毒应答。在此，研究人员表明RIG-I不仅结合病毒RNA，还会被宿主RNA激活。这些宿主RNA主要是由RNA聚合酶III（RNA po
先天免疫传感器必须精细区分病原体与宿主，以便仅在感染期间启动应答。RIG-I是一种细胞质传感器，在感知外源RNA后触发广泛的抗病毒应答。在此，研究人员表明RIG-I不仅结合病毒RNA，还会被宿主RNA激活。这些宿主RNA主要是由RNA聚合酶III（RNA polymerase III）转录的非编码RNA（non-coding RNAs）。它们在正常条件下是无害的，但在流感病毒感染期间会变得具有免疫原性，并通过RIG-I发出信号以抑制病毒复制。这些RNA也会被流感病毒核蛋白（nucleoprotein, NP）结合，NP的正常功能是包裹病毒基因组。NP通过RNA桥与RIG-I相互作用，并拮抗对自身RNA的感知，从而对抗先天免疫应答。总体而言，研究人员证明自身感知被细胞策略性地用于放大抗病毒应答，并揭示了一种新发现的病毒对抗措施，该措施破坏了宿主RNA对RIG-I的激活。
论文解读
研究背景与科学问题
先天免疫系统依赖模式识别受体（如RIG-I样受体RLRs）区分“自我”与“非我”核酸。RIG-I作为关键的细胞质RNA传感器，通常被认为通过识别病毒RNA特有的5'三磷酸（5' PPP）结构来启动抗病毒信号。然而，RIG-I在生理条件下持续采样大量RNA分子，其中绝大多数是宿主RNA。以往观点认为，RIG-I对自身RNA的异常感知会导致自身炎症性疾病（如Singleton-Merten综合征和Aicardi-Goutières综合征）。但近期证据暗示，这种“自身感知”在病毒感染中可能发挥保护作用。本研究旨在定量解析RIG-I在无菌条件和病毒感染下所结合的RNA全貌，并探究流感病毒如何应对这一潜在的抗病毒机制。
研究方法概述
研究人员开发了带有外源spike-in对照的交联免疫共沉淀测序（CLIP-Seq）技术，以实现不同条件下RIG-I结合RNA的准确定量比较。关键方法包括：利用果蝇S2细胞制备spike-in对照进行内部归一化；采用双轮比对和从头转录组组装精确量化重复非编码RNA家族；通过RNaseH介导的病毒RNA特异性耗竭实验区分宿主与病毒RNA的免疫原性贡献；使用牛痘加帽酶标记并纯化5'二磷酸/三磷酸（5' PP/PPP）RNA；以及利用反义寡核苷酸（ASO）捕获从感染细胞中纯化特定内源性RNA，再将其重新导入报告细胞进行功能验证。研究使用了人A549肺上皮细胞、稳定表达RIG-I或NP的细胞系、DDX58（RIG-I基因）和MAVS敲除细胞系，以及原代人支气管上皮细胞（NHBE，来自一名55岁白人男性）及其气液界面分化培养模型。
主要研究结果
1. RIG-I即使在感染期间也主要结合宿主RNA
通过定量CLIP-Seq发现，无论在模拟感染、甲型流感病毒（FLUAV）还是水疱性口炎病毒（VSV）感染条件下，RIG-I结合的RNA中绝大部分（>85%）来源于宿主。病毒RNA仅占FLUAV感染下约15%的结合量，而VSV RNA甚至未显著富集。RIG-I优先结合一类特定的宿主非编码RNA（ncRNA），主要为RNA聚合酶III（Pol III）的转录产物，包括Y RNA（RNY）、穹窿体RNA（vtRNA）、U6 snRNA（RNU6）、Alu RNA和tRNA。主坐标分析显示RIG-I结合谱与总输入RNA显著分离，表明其与一个受限的RNA库互作。感染并未显著改变RIG-I对大多数宿主RNA的结合强度，但病毒RNA的结合峰（主要位于基因组末端）则大幅增加。
2. 流感病毒NP结合宿主非编码RNA
免疫共沉淀实验证实，流感病毒核蛋白（NP）与RIG-I以RNA依赖的方式相互作用。NP的eCLIP-Seq分析显示，除了约75%的病毒RNA外，约25%的结合序列来源于宿主。这些宿主RNA同样高度富集于Pol III转录的ncRNA，如vtRNA、Y RNA、U6、7SK和7SL RNA等。尽管NP的RNA结合是非序列特异性的，但它对这类小ncRNA表现出显著的偏好（占总读数的70%以上）。与ENCORE数据库对比发现，NP的RNA结合谱异常广泛，聚类于多种参与ncRNA加工的RNA结合蛋白附近。
3. 感染动态调控NP的RNA结合谱
利用spike-in定量CLIP-Seq比较NP单独诱导表达与病毒感染条件下的结合谱，发现超过40%的结合峰仅在感染条件下出现。例如，U6 snRNA仅在感染时才被NP结合，而Y1 RNA和7SK RNA的结合强度在感染后进一步增强。亚细胞分级实验表明，NP的结合偏好与其定位密切相关：感染后期NP主要分布于胞质，此时它优先结合胞质中的ncRNA；而诱导表达时NP滞留于核内，则更多结合核内lncRNA（如MALAT1）。
4. NP结合的宿主ncRNA通过RIG-I发出信号
RIG-I与NP在多个宿主ncRNA上的结合位点显著重叠。从感染细胞中纯化的NP-RNA复合物能强烈激活干扰素刺激反应元件（ISRE）报告基因，而这一活性依赖于RIG-I和其适配蛋白MAVS。即使通过RNaseH去除病毒RNA后，NP结合RNA仍能激活ISRE，证明宿主RNA本身具有免疫原性。体外转录的U6、vtRNA1-1和Y4 RNA均能以剂量依赖方式激活RIG-I信号，且该激活完全依赖于RNA的5' PPP结构——经磷酸酶处理后活性消失。
5. NP拮抗免疫原性宿主RNA的抗病毒活性
利用ASO从感染细胞中纯化的内源性U6、Y4和vtRNA1-1能够有效激活ISRE和IFNβ启动子，而从模拟感染细胞中纯化的相同RNA则无此效应。这归因于感染导致这些RNA上5' PPP的保留率显著升高。更重要的是，将感染细胞来源的这些RNA重新导入A549细胞后，可使其后续的流感病毒滴度下降约100倍，且该抑制作用完全依赖于RIG-I。在原发性NHBE细胞及其气液界面分化模型中同样验证了这一现象。进一步研究表明，定位于胞质的NP突变体（K7A/R8A）能够完全阻断Y4 RNA诱导的ISRE激活，而野生型核定位NP则无效，说明NP通过进入胞质结合宿主ncRNA来直接破坏RIG-I对其的感知。
讨论与结论
本研究揭示了RIG-I介导的“自身感知”是抗流感病毒先天免疫的重要组成部分。正常情况下无害的宿主Pol III转录本在感染过程中因5' PPP修饰保留而获得免疫原性，成为RIG-I的激动剂，从而放大抗病毒应答。流感病毒NP则作为一种新发现的病毒对抗因子，通过与这些免疫原性宿主RNA结合并干扰RIG-I的活化循环来抑制自身感知。由于所有负链RNA病毒及部分正链RNA病毒（如冠状病毒）都表达具有类似非特异性RNA结合特性的核蛋白，本研究提出了一种普遍存在的病毒免疫逃逸机制。研究结论强调，RIG-I激活的平衡被细胞有意打破——同时利用宿主和病毒RNA提供平行的先天免疫激活途径，而病毒则进化出针对宿主RNA感知的特异性反制措施。
