应激适应型肌纤维状态促进线粒体DNA缺失的克隆扩增

《Cell Reports》：A stress-adapted fiber state promotes clonal expansion of deleted mitochondrial DNA

　　

摘要专业翻译 线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）耗竭与多发性缺失在线粒体疾病、神经退行性疾病及衰老中频繁共存，然而两者之间的关联以及缺失为何呈局灶性积累仍未阐明。本研究通过对Mpv17?/?小鼠肌肉进行纵向组织整体及原位分析发现，每个mtDNA分子对应的线粒体RNA（mtRNA）水平代偿性升高，最初抵消了严重的、均匀的mtDNA耗竭，从而维持呼吸链功能。然而，这一代偿反应伴随着延迟性代价：至6月龄时转录本水平下降，mtDNA缺失出现，呼吸链缺陷纤维显现。矛盾的是，携带缺失的纤维尽管先前存在耗竭，却积累了超生理水平的mtDNA。这种扩增总是伴随Hsp60升高，人类线粒体肌病中亦复如此。研究人员提出，耗竭重编程了线粒体DNA和RNA代谢，不经意间促进了缺失的形成，并创造了一种Hsp60高表达的纤维状态，该状态允许缺失mtDNA进行克隆扩增。因此，耗竭与多发性缺失可以是一种共同退行过程的连续阶段，这一发现亦与衰老和神经退行性病变相关。

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一、研究背景与科学问题

线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）功能障碍是众多人类遗传疾病的病理基础。除数百种原发性致病性mtDNA变异外，多个核基因的突变可导致继发性mtDNA不稳定，其缺陷基因产物或扰乱核苷酸稳态，或直接损害DNA复制机器，从而引起mtDNA拷贝数的定量丢失（即耗竭）或缺失分子的产生。值得注意的是，同一基因的突变可同时导致耗竭与缺失，且二者可在同一组织中共存。这引发了两个核心问题：耗竭本身是否促进缺失mtDNA的形成？若如此，其机制为何？另一个悬而未决的问题是：在终末分化组织中，缺失mtDNA如何实现所谓的克隆扩增——这一过程见于遗传性线粒体疾病、晚发性神经退行性疾病及衰老过程中。鉴定参与其中的关键分子至关重要，因为它们可能成为限制mtDNA缺失积累、从而延缓或阻止疾病进展的治疗靶点。

为在体内剖析mtDNA异常的起源与演变，研究人员选用了Mpv17^?/?小鼠——一个成熟的mtDNA维持缺陷模型。在人类中，线粒体内膜蛋白MPV17功能缺失导致核苷酸不足，引起早发性mtDNA耗竭或晚发性肌肉中缺失mtDNA的克隆扩增。尽管Mpv17^?/?小鼠肌肉呈现早发性mtDNA耗竭，但局灶性呼吸链缺陷仅至成年后期才出现。这种延迟性功能损害的机制基础以及mtDNA缺失是否共存，此前从未被探究。

二、研究内容与总体结论

研究人员结合组织整体与单纤维分析方法，纵向追踪了Mpv17^?/?小鼠肌肉中mtDNA拷贝数、表达及完整性。研究发现：耗竭引发线粒体RNA代谢的代偿性重编程，这种重编程虽抵消了mtDNA的损失，却易化了缺失的形成，并创造了一种以热休克蛋白60（Hsp60）高表达为特征的应激适应状态，该状态促进了缺失mtDNA的克隆扩增。这一发现将耗竭与多发性缺失重新定义为同一退行过程的连续阶段，对理解衰老与神经退行性病变具有重要意义。

三、主要关键技术方法

研究人员采用多种技术手段开展研究。动物模型方面，使用C57Bl/6J Mpv17^?/?小鼠，并与同窝野生型对照比较，涵盖2至16月龄多个时间点。人类样本方面，分析了来自RRM2B、TK2、POLG、SPG7、TWNK核基因致病性变异或单个大片段mtDNA缺失患者的肌肉活检切片。技术方法上，采用定量PCR（qPCR）测定mtDNA拷贝数、长程PCR（LR-PCR）与Southern印迹检测缺失、限制性酶切图谱与单分子纳米孔测序（Oxford Nanopore sequencing）鉴定缺失断点、比较qPCR估算缺失负荷；组织原位层面，运用抗DNA抗体免疫染色、改良的RNAscope方案（mtDNA-scope）原位检测mtDNA、滚环扩增（RCA）挂锁探针进行单分子原位检测，以及免疫组化检测Cox1、Hsp60、Atf5、磷酸化S6核糖体蛋白（pS6）等标志物。

四、研究结果

（一）升高的mtRNA:mtDNA比值在年轻Mpv17^?/?肌肉中维持呼吸链功能，尽管存在严重mtDNA耗竭

2至3月龄Mpv17^?/?小鼠肝脏mtDNA耗竭约90%，肌肉约75%，与患者情况高度吻合。肌肉中dGTP水平下降约90%，提示dGTP不足是Mpv17缺陷中mtDNA耗竭的基础。尽管耗竭程度相似，肝脏呼吸链蛋白显著降低，而年轻Mpv17^?/?小鼠肌肉呼吸链蛋白与对照相当，几乎所有肌纤维COX染色阳性。机制上，肌肉中每个mtDNA分子的mtRNA水平较对照升高约3倍，使mtRNA总量维持在对照的约70%，高于维持呼吸链功能所需的50%阈值；而肝脏mtRNA仅达对照的约40%，低于阈值。转录因子Tfb2m和mtRNA聚合酶Polrmt按mtDNA拷贝数归一化后升高5倍，而线粒体转录抑制因子Top1mt显著降低，提示Top1mt抑制通过增加启动子处Tfb2m装载和Polrmt募集来刺激转录。

（二）Fgf21及其他线粒体功能障碍标志物自年轻时期即在Mpv17^?/?肌肉中升高

尽管年轻Mpv17^?/?小鼠无明显的呼吸链缺陷，但线粒体肌病的两大标志物Fgf21和Gdf15在3月龄时已升高4至12倍，并随年龄持续上升，至16月龄达60至80倍。Mthfd2的表达轨迹相同，12及16月龄时分别达对照的约7倍和10倍。这表明Mpv17缺陷激活了肌肉中的应激相关转录程序，且疾病呈进行性发展。

（三）随Mpv17^?/?小鼠衰老，缺失mtDNA出现并积累，而线粒体转录本下降

长程PCR显示缺失分子在2至3月龄时缺如、6月龄时占少数、12至16月龄时占多数。Southern印迹和免扩增纳米孔测序独立证实了缺失mtDNA的存在。缺失断点分析显示，大部分缺失分子保留主要非编码区（D-loop）、12S rRNA基因及细胞色素b和16S rRNA基因的部分，而mt-Co1至mt-Co3及大部分tRNA基因被删除。32个缺失中30个同时涉及大弧和小弧，OL在除一个外的所有大缺失中丢失，仅两个连接点涉及直接重复序列，13个连接点完全平端，提示缺失源于复制而非修复。比较qPCR显示，16月龄时D-loop估计的mtDNA拷贝数（40%）超过mt-Co2估计值（25%），差异部分相当于缺失分子占全部mtDNA的约三分之一。纵向分析显示线粒体转录本水平从年轻时的对照70%降至6月龄的55%、12月龄的40%，提示转录而非复制被牺牲。

（四）缺失mtDNA呈局灶性扩增

抗DNA抗体免疫染色显示，10至12月龄Mpv17^?/?小鼠约1%的肌纤维含远超周围的mtDNA焦点（DNA⁺⁺⁺纤维），13至16月龄升至约5%，其焦点数超过所有对照纤维。mtDNA-scope检测显示D-loop探针在部分纤维中信号大量增加，而mt-Co1探针无相应高信号纤维。挂锁探针RCA分析进一步证实，高D-loop信号纤维中的丰富mtDNA主要是缺失分子。所有DNA⁺⁺⁺纤维均表现为Cox1蛋白和RNA水平缺陷，且缺失mtDNA保留在线粒体网络中而非进入溶酶体降解途径。

（五）Hsp60的局灶性转录激活先于缺失mtDNA的扩增

6月龄起，Mpv17^?/?小鼠肌肉中出现Hsp60强阳性纤维，10至12月龄占3%，13至16月龄占8%，对照肌肉中始终缺如。RNAscope证实Hsp60上调是转录反应。DNA⁺⁺⁺纤维无一例外地强染Hsp60；未达DNA⁺⁺⁺阈值的Hsp60⁺纤维平均mtDNA数量已是Hsp60基础水平纤维的3倍，提示Hsp60诱导先于克隆扩增。约三分之一的Hsp60⁺纤维维持Cox1表达，提示部分纤维中Hsp60升高可能有助于维持呼吸链功能。Atf5分析显示，39%的Hsp60⁺纤维缺乏可检测的Atf5，表明哺乳动物Atf5并非线虫ATFS-1的等同物，而是标记承受最严重mtDNA应激的纤维。

（六）线粒体增殖与mTORC1激活是mtDNA扩增的响应而非诱因

Cox缺陷纤维比例从6月龄的2%升至12月龄的8%、13至16月龄的13%。线粒体增殖（ ragged red fibers, RRF）在10至12月龄占1%、13至16月龄占4至5%。所有RRF均为Hsp60⁺，但Hsp60⁺纤维数量约为RRF的3倍，表明Hsp60诱导先于线粒体增殖。pS6⁺纤维在12月龄前仅占0.8%，13至16月龄升至2.3%，远少于RRF和Hsp60⁺纤维；仅四分之一至一半的DNA⁺⁺⁺纤维为pS6⁺。因此mTORC1激活是线粒体功能障碍的晚期反应，并非线粒体增殖、mtDNA扩增或Hsp60转录激活所必需。

（七）人类线粒体肌病再现Mpv17^?/?小鼠的关键新病理特征

在RRM2B、TK2、POLG、SPG7、TWNK突变或单个大片段mtDNA缺失的患者肌肉中，4至21%的纤维同时为COX缺陷和HSP60⁺，约37至80%的COX缺陷纤维为HSP60⁺，与小鼠13至16月龄时近40%的比例高度一致。HSP60⁺纤维数量平均为RRF的3倍，pS6⁺纤维最为稀少。TK2突变肌肉中，HSP60⁺纤维的mtDNA焦点数为基础水平纤维的2倍。小鼠模型中Hsp60升高与mtDNA扩增并存于mtDNA耗竭背景的组合模式，在人类线粒体肌病中得到完整再现。

五、讨论与结论

研究人员提出缺失mtDNA克隆扩增的多步骤模型：dNTP短缺引起的mtDNA耗竭触发线粒体转录代偿性升高；持续的高水平转录与较高比例的活跃复制mtDNA构成双重复制-转录应激，导致复制-转录冲突，既产生缺失mtDNA，又诱导Hsp60高表达的纤维状态；Hsp60可能通过结合单链DNA、缺失分子失去复制暂停位点、缩短复制周期等机制，赋予缺失分子复制优势，最终实现克隆扩增。耗竭与缺失被重新定义为同一退行过程的连续阶段而非替代性终点。HSP60被确立为线粒体肌病的新标志物，优于传统RRF。mtDNA扩增先于线粒体增殖，提示克隆扩增驱动线粒体生物发生。mTORC1激活和Atf5诱导均为晚期反应。研究的主要局限在于尚未确立Hsp60与克隆扩增之间的因果关系，以及复制-转录冲突假说仍属推断。