马精子中γH2AX的流式细胞术首次检测及其与DNA状态和凋亡样变化的关系

《Life》：First Detection of γH2AX in Equine Spermatozoa Through Flow Cytometry and Its Association with DNA Status and Apoptotic-like Changes

　　

摘要：组蛋白H2A家族成员X在丝氨酸139位点的磷酸化（γH2AX）是细胞对DNA双链断裂反应的标志物。据研究人员所知，本研究首次报道了通过流式细胞术在马精子中检测γH2AX，并通过其与DNA状态和凋亡样变化的关联提供了初步证据。研究人员在常规田间条件下分析了来自12匹种公马的64份精液样本。采用多参数流式细胞术评估了精子活力、线粒体膜电位、Annexin V阳性率和γH2AX水平。γH2AX在样本间呈现广泛分布，并与Annexin V阳性率和PI阳性率相关。将种公马作为随机效应的线性混合效应模型显示，γH2AX水平与Annexin V阳性率和PI阳性率均存在显著关联。相反，γH2AX与精子活力或线粒体膜电位无显著相关性。这些发现表明，γH2AX相关荧光可在马精子中检测到，并与凋亡样变化和DNA不稳定性指标相关，这可能与核DNA损伤而非一般精子功能状态有关。观察到的关联提示，γH2AX可能作为多参数流式细胞术中评估种公马精子核状态的额外参数。然而，需要针对已建立的DNA损伤检测方法和适当的特异性对照进行进一步验证，以确定γH2AX荧光是否能提供马精子核DNA损伤的特异性测量。

研究背景与问题

流式细胞术已成为生殖生物学中的重要工具，能够快速、客观地对精子质量进行多参数评估。在传统精液分析中，活力和形态等参数并不能完全反映精子的功能状态或受精潜力。在马的繁殖实践中，人工授精广泛应用，因此准确评估精子质量对于优化生育力结局至关重要。然而，现有方法在评估精子DNA完整性方面仍存在局限，尤其是在马属动物中。DNA损伤与生育力下降、胚胎发育缺陷、妊娠丢失增加以及对后代健康的长期影响密切相关。因此，引入新的生物标志物来改善精子功能能力的表征显得尤为必要。

γH2AX（组蛋白H2AX在Ser139位点的磷酸化形式）是DNA双链断裂的公认标志物，在体细胞研究中被广泛用于检测DNA损伤。在人精子中，γH2AX已通过流式细胞术成功检测，并被提出作为DNA损伤的生物标志物。然而，据研究人员所知，γH2AX此前尚未通过流式细胞术在马精子中进行评估。因此，本研究旨在首次报告通过流式细胞术在马精子中检测γH2AX，并通过其与已建立的精子功能和DNA参数的关联来评估其生物学相关性。

研究方法与技术路线

研究人员从12匹年龄介于5至19岁的种公马中采集了64份精液样本，品种包括Pura Raza Espa?ola、Arabian、Anglo-Arabian、Hispano-Arabian和Spanish Sport Horse（CDE），样本收集于2022年和2024年的繁殖季节，反映了典型的田间条件。所有种公马均饲养于西班牙巴达霍斯的CENSYRA（动物选择与繁殖中心）。精液使用预热的INRA型人工阴道采集，并在稀释后以25×10⁶精子/mL的浓度运输至埃斯特雷马杜拉大学的研究支持服务处（STAB）。每份样本分为两份等分试样，一份在采集后3小时内进行评估（标记为0小时），另一份在5°C下储存约24小时后进行评估。

主要技术方法包括：

1. 1.
   多参数流式细胞术：使用Hoechst 33258鉴定非存活精子，TMRM评估线粒体膜电位，Annexin V-FITC检测磷脂酰丝氨酸外翻（凋亡早期标志），PI评估膜完整性。另取等分试样进行固定和透化处理后，使用抗phospho-H2AX（Ser139）单克隆抗体进行细胞内染色，随后以DyLight 549偶联的二抗检测荧光信号。
2. 2.
   数据采集与分析：使用MACSQuant VYB流式细胞仪采集数据，每样本记录至少10,000个事件，采用FlowLogic软件进行分析。基于前向和侧向散射特性识别精子，并使用FSC-A/FSC-H参数排除双联体。设立染色对照以确定阳性阈值和补偿，并为phospho-H2AX检测设置二抗单独对照。
3. 3.
   统计分析：使用Jamovi软件进行数据分析。计算Pearson相关系数以评估γH2AX水平与精子参数之间的关系。构建以γH2AX为因变量、Annexin V阳性和PI阳性为固定效应、种公马为随机效应的线性混合效应模型，以处理重复测量的非独立性。

研究结果

描述性分析：64份样本的精子活力（Live Total）平均值为52.9±23.2%，线粒体膜电位（TMRM）平均值为40.0±23.9%。Annexin V阳性率平均为21.3±24.7%，显示样本间凋亡样变化的高度变异。γH2AX水平范围为2.74%-85.9%，平均值为22.7±20.9%，中位数为15.8%，呈中等偏态分布。未浓缩核的比例平均为20.5±13.1%。

相关性分析：在精液样本层面，γH2AX阳性精子比例与Annexin V阳性率呈正相关（r=0.700，p<0.001），与PI阳性率也呈正相关（r=0.762，p<0.001），提示DNA完整性与凋亡样变化之间可能存在关系。在包含种公马作为随机效应的线性混合效应模型中，Annexin V阳性率（β=0.315±0.094，p=0.002）和PI阳性率（β=0.806±0.173，p<0.001）均与抗体衍生信号显著相关。而γH2AX与精子活力（Live Total）和线粒体膜电位（TMRM）之间存在较弱的负相关关系，但未达到统计学显著性。

线性混合模型分析：模型表现出较高的解释力（边际R2=0.852；条件R2=0.876；p<0.001），表明纳入的变量解释了γH2AX水平的大部分变异性。Annexin V阳性率（β=0.315±0.094，p=0.002）和PI阳性率（β=0.806±0.173，p<0.001）均与γH2AX显著相关。种公马间的方差贡献适中（ICC=0.165），表明γH2AX的变异主要由测量的细胞参数解释，而非个体差异。

附加混合模型分析：γH2AX与精子活力（Live Total，p=0.969）和线粒体膜电位（TMRM，p=0.211）均无显著关联，表明抗体衍生荧光信号与这两个功能参数之间不存在关联。

图形分析：散点图确认了统计关联，γH2AX水平与Annexin V阳性率和PI阳性率均呈正相关，而与精子活力和线粒体膜电位无明显关系。

讨论与结论

本研究报告了通过流式细胞术在马精子中检测到抗phospho-H2AX抗体相关荧光，并在样本水平上观察到抗体阳性率与Annexin V阳性率、PI阳性率以及未浓缩核比例之间的可能关联。这一发现可能代表马科动物生殖学中的一项新颖的方法学和生物学贡献。

γH2AX水平较高与Annexin V阳性率升高相关联，表明马精子中DNA损伤与凋亡样变化之间可能存在关系。这与哺乳动物精子中将DNA片段化与凋亡相关过程和膜改变联系起来的先前报告一致。有趣的是，γH2AX与精子活力或线粒体膜电位无显著关联，表明其更紧密地关联于核不稳定性而非一般功能状态。

线性混合模型分析进一步支持了这些关联的稳健性，表明Annexin V、PI以及可能的DNA去浓缩可构成γH2AX水平变异性的重要解释因素，且独立于种公马变异。研究纳入了在不同条件下处理的样本，包括多种稀释剂和两个时间点（0小时和24小时），这增加了生物学变异性，并使γH2AX能够在常规马繁殖实践中常见的情景下进行评估。这种异质性反而增强了研究发现的相关性，因为关联在不同生理和处理条件下得以维持。

研究局限性包括：γH2AX检测未直接针对已建立的DNA损伤检测方法如TUNEL或SCSA进行验证；抗CR55T33抗体在马精子中的结合特异性未独立确立；DNA去浓缩可能增加表位可及性并对测量信号产生贡献；由于终点指标在不同等分试样中评估，样本水平的关联不能证明单个精子内的共定位或共享细胞机制；缺乏直接的生育力结局数据进行预测价值评估。

研究结论：使用针对γH2AX（Ser139）的抗体，在马精子中获得了流式细胞术荧光信号。在精液样本中，抗体阳性精子比例与Annexin V阳性和PI阳性比例相关联，而与活力或线粒体膜电位无显著关联。这些探索性发现需要在马精子中验证信号特异性并进行联合单细胞评估，才能确定关联的生物学基础或该检测方法作为DNA损伤标志物的潜在价值。需要进行将γH2AX与已建立的DNA片段化检测方法和生育力结局进行比较的进一步研究，以确定其作为种公马生育力评估中补充生物标志物的潜在价值。